Enxergando células antes invisíveis







 
[Livremente traduzido de: Seeing Previously Invisible Molecules for the First Time ]

Uma nova técnica de microscopia revela moléculas, antes invisíveis, em cores

Image of individual red blood cells lined up within a single capillary in a mouse's ear.

Imagens de células sanguíneas individuais dentro de um vaso capilar na orelha de um rato.
Crédito e imagem ampliada

22 de outubro de 2009

Uma equipe de quimi­cos de Harvard, lide­rada por X. Sunney Xie, de­sen­vol­veu uma nova técnica de mi­cros­copia para vi­sua­li­zar, em cores, mo­lé­cu­las com fluorescência indetec­tável. O processo, de temperatura ambiente, permite aos pesquisa­dores identificar moléculas que antes não podiam ser vistas, em organismos vivos e pode ter vastas aplicações em imageamento diagnóstico e pesquisas biomédicas. 

Os resultados obstidos pelos cientistas foram publicados na edição de 22 de outubro da Nature. A pesquisa foi parcialmente financiada pela Fundação Nacional de Ciências (NSF).

A fluorescência é o fenômeno onde um elétron que faz parte de uma molécula, absorve a energia da luz e passa para um nível quântico acima – fica em estado excitado – sendo esse quantum de energia igual à da partícula portadora da energia eletromagnética, o fóton. Após uma breve permanência nesse estado excitado, o elétron volta a seu nível de energia anterior, ou estado fundamental, emitindo um novo fóton. A energia do fóton liberado está na faixa de comprimento de onda da luz visível, durando apenas uns poucos bilionésimos de segundo.

Image of the delivery of toluidine blue O to the outer most layer of skin in a mouse ear.

Imagem do envio de “azul de toluidina” até a camada mais externa da pele da orelha de um rato
Crédito e imagem ampliada

Muitas moléculas coloridas e biologicamente importantes, tais como a hemoglobina – uma proteína portadora de oxigênio nos glóbulos vermelhos do sangue – absorvem a luz, porém não ficam fluorescentes. Em lugar disso, elas liberam a energia transitória em comprimentos de onda não visíveis (calor).

Como diz Xie: “Já que essas moléculas não ficam fluorescentes, elas foram literalmente ignoradas pelos modernos microscópios ópticos”.

Então, para detectar essas moléculas não fluorescentes nos sistemas biológicos, Xie e sua equipe desenvolveram uma nova técnica de microscopia com base na emissão estimulada.

A emissão estimulada foi primeiramente descrita por Albert Einstein em 1917 e é a base dos lasers atuais. Em resumo, é um processo pelo qual um elétron em estado excitado, perturbado por um fóton com a energia adequada, decai para seu estado fundamentas produzindo um fóton adicional.

A nova técnica de microscopia de Xie gera e grava um sinal de emissão estimulada mediante o uso de dois pulsos, cuidadosamente escalonados, um de excitação e outro de estimulação. Cada pulso tem uma duração incrivelmente curta de aproximadamente 200 femtossegundos e uma frequência de 76 MHz. Um femtossegundo é um bilionésimo de um milionésimo, ou 10-15, de segundo. Um modulador comuta a intensidade dos pulsos de excitação, ligando e desligando a cinco MHz. Essa modulação cria um sinal de emissão estimulada na mesma frequência. O sinal produzido pelas moléculas não fluorescentes fornece uma imagem de alta sensibilidade das moléculas antes “invisíveis”.

Uma dentre várias possíveis aplicações da invenção dos cientistas é o mapeamento a cores do suprimento de drogas não fluorescentes às células-alvo. Outro possível emprego é o imageamento de pequeninas estruturas, tais como vasos sanguíneos, até de células vermelhas sanguíneas individuais e capilares singelos (vide imagens).

A estrutura e a dinâmica da hemoglobina nos vasos sanguíneos têm um improtante papel em vários processos biomédicos. Dois exemplos desses processos são a transição de estado de tumores, de latente para maligno, e a oxigenação no cérebro.

As técnicas atualmente estabelecidas de imageamento, tais como ressonância magnética e tomografia computadorizada, ou não têm a definição necessária para identificar capilares individualmente, ou precisam de agentes de contraste externos.

Agentes de realce, tais como a proteína fluorescente verde (green fluorescent protein = GFP), vêm sendo extensivamente empregados para observar a atividade de biomoléculas e para distinguir as moléculas-alvo em uma célula. A técnica de realce com GFP fornece imagens com boa definição, porém a proteína, por ter uma molécula demasiadamente grande, pode perturbar os delicados caminhos bilógicos, especialmente quando ela é maior do que a biomolécula que está realçando.

Image of the delivery of toluidine blue O to the deepest layer of skin in a mouse ear.

Imagem do envio de “azul de toluidina” à camada mais externa da pele da orelha de um rato.
Crédito e imagem ampliada

A equipe de Xie mapeou a entrega de uma molécula de droga não fluorescente e imageou vasos sanguíneos sem o uso de agentes de realce fluorescentes. A nova técnica é também capaz de imagear proteínas não fluorescentes em células de bactérias Escherichia coli  vivas.

Zeev Rosenzweig, diretor de programa na Divisão de Química da NSF, diz: “Enquanto estudos anteriores fizeram uso de experimentos de sondagem por injeção de energia para obter imagens de moléculas fluorescentes com uma resolução espacial comparável à da microscopia de fluorescência confocal e alta resolução temporal, este estudo usa, pela primeira vez, microscopia de emissão estimulada para obter imagens de moléculas não fluorescentes”. 

Embora os potenciais danos causados pela forte luz e a complexidade e o custo do sistema ainda sejam objeto de futuros aperfeiçoamentos para que a técnica obtenha ampla aplicabilidade, “não há dúvida de que o estudo indica um caminho ímpar para imagear uma ampla gama de moléculas, atualmente inacessível aos atuais microscópios de ponta”, como observa Rosenzweig.

“Isso é apenas o começo”, acrescenta Xie. “Muitas aplicações interessantes dessa nova modalidade de imageamento estão por vir”.

Os demais autores do artigo na Nature incluem Wei Min, Sijia Lu, Shasha Chong, Rahul Roy e Gary R.
Holtom. Min e Roy  são doutores; Lu e Chong são estudantes de pós-graduação; e Holtom é cientista pesquisador, todos membros do grupo de pesquisas de Xie.


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