bioquímica bela

Células em prófase (esq.) e anáfase (dir.), com histonas e taxas de crescimento de microtúbulos. Gráfico mostra distribuição de taxas de crescimento de diferentes estágios da mitose, numa média a partir de um grupo de 9 a 12 células. [Crédito: Betzig Lab/HHMI]

Contrações musculares. Interações celulares. Citocinese. Intérfase. Metáfase. Anáfase. Presentes nas aulas de Biologia a partir do ensino médio, esses termos designam fenômenos riquíssimos que — como algumas reações químicas bem mais simples — estão acontecendo em cada ser vivo presente neste momento. Também há muita beleza oculta nos laboratórios de Bioquímica. E ela também está sendo descoberta e observada com novas tecnologias na microscopia, que começaram a ser desenvolvidas há 10 anos por Eric Betzig. Os resultados começam a aparecer agora e são tão promissores que já lhe valeram um Prêmio Nobel.

A nova tecnologia chama-se lattice light sheet microscope [algo como microscópio de folha de luz treliçada] e permite que biólogos moleculares façam vídeos de processos biológicos de diversas escalas temporais e espaciais: dos movimentos de proteínas isoladas ao desenvolvimento embrionário. Além de Eric Betzig, do Janelia Research Campus, vinculado ao Howard Hughes Medical Institute, a pesquisa contou com a colaboração dos pós-doutorandos Bi-Chang Chen (Research Center for Applied Sciences de Taiwan), Wesley Legant e Kai Wang. A descrição do novo microscópio e suas aplicações foram publicadas pelos autores na edição de ontem da revista Science. O paper publicado contém os primeiros vídeos experimentais produzidos pelos pesquisadores.

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Eric Betzig. [Betzig Lab/HHMI]

Betzig foi um dos três laureados com o Prêmio Nobel de Química de 2014. Há dez anos, ele vem desenvolvendo novas tecnologias de imageamento microscópico, especialmente para a área bioquímica. Suas teorias e técnicas têm permitido que os biólogos possam observar de maneira mais clara e mais direta os movimentos das menores estruturas celulares. Mas todo avanço tem seus preços. Fazer imagens da vida íntima das células em alta resolução e em 3D implicava no sacrifício da velocidade da imagem e até mesmo causava danos às células por toxidade foto-induzida.

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Renderização em oito pontos consecutivos de um protozoário da espécie T. thermopila. Tomado de um conjunto de 1250 pontos temporais. [Crédito: Betzig Lab/HHMI]

O novo microscópio é um aperfeiçoamento de outro revelado por Betzig em 2011 e usa alguns truques para resolver os problemas do chamado plano Bessel (o lençol de luz virtual com que o microscópio ilumina as amostras). “Não era apenas um refinado pincel de luz – ele tinha uns lóbulos laterais escurecidos”, explicou Betzig ao Phys.org. “Assim, quando varria-se a amostra, você tinha uma luz desfocada”. Uma solução seria mudar a posição do plano passo-a-passo pela amostra e depois corrigir os borrões computacionalmente — uma técnica conhecida como iluminação estruturada. Uma espécie de photoshop científico.

No vídeo a seguir, por exemplo, podemos observar o plano Bessel em ação durante a observação de uma fechadura dorsal de um embrião de D. melanogaster que expressa GFP/DE-cadherin para realçar as junções celulares.

Movie S16 High Resolution from HHMI NEWS on Vimeo.

A iluminação estruturada também pode ser usada para superar os limites dos microscópios ópticos comuns. Ao aplicar essa técnica de super-resolução, Betzig e seus colaboradores conseguiram mover o plano Bessel de modo a produzir um padrão de luz parecido com uma treliça. “Nós não apenas nos livramos do problema do lóbulo escuro, nós acabamos ultrapassando um pouco o limite de difração”, diz Betzig. Como ainda havia o problema da toxidade da luz para algumas amostras que exigiam longas exposições, os pesquisadores resolveram dividir o plano Bessel em sete partes paralelas. Segundo Betzig, a foto-toxidade “foi pra baixo” com sete feixes de luz. Esse efeito poderia ser melhorado com mais divisões?

Betzig voltou às suas teorias, retomando inclusive aspectos do começo do seu trabalho, quando já imaginava uma técnica para limitar danos às células com o uso de um largo arranjo tridimensional de focos de luz. Isso foi em 2005, quando Betzig estava chegando ao Instituto Janelia e não teve muito tempo para testar a ideia. Em seu novo modelo, ele propôs certas modificações que permitiram a destruição dos indesejáveis lóbulos escurecidos.

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Bi-Chang Chen [Betzig Lab/HMMI]

Ao longo de meses de trabalho, Chen e Wang botaram essas modificações em prática em testes experimentais. Os resultados mostraram que esses (velhos) novos arranjos mataram três coelhos numa cajadada só: a folha de luz treliçada é o tipo de plano estruturado que (1) espalha a energia luminosa, (2) reduz a foto-toxidade e (3) anula o problema dos lóbulos.

O novo microscópio opera em dois modos. Um usa o princípio da iluminação estruturada para criar imagens de alta resolução. Nesse caso, a imagem final é formada pela coleta e processamento das múltiplas imagens de cada plano da amostra. O imageamento pode ser acelerado para capturar processos mais velozes — ainda que com uma resolução menor, chamada de modo “pontilhado”. Nesse modo pontilhado, a exposição luminosa é menor e portanto as células sofrem menos danos.

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Kai Wang [Betzig Lab/HHMI]

A alta resolução do novo aparelho permite a gravação de movimentos de proteínas em três dimensões. “Normalmente,” — explica Betzig — “quando se fazem estudos de uma única molécula, eles têm de ser feitos em células planas e finas, porque a luz ficaria desfocada com a espessura”. Essa limitação foi superada com o sistema de iluminação estruturada recém-descoberto. A varredura por folha de luz treliçada permite que moléculas individuais sejam vistas mesmo em grandes amostras multicelulares. O novo microscópio é ágil o bastante para rastrear a rapidez do crescimento e retração de componentes do citoesqueleto durante a divisão celular. Ou as contrações musculares musculares num embrião de C. elegans, gravadas no vídeo a seguir:

Movie S6 High Resolution from HHMI NEWS on Vimeo.

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Wesley Legant [Betzig Lab/HHMI]

Betzig e seus colaboradores também estão sendo bastante ágeis na divulgação do invento. Além dos dois vídeos que apresentamos aqui, foram publicados outros 30 neste canal do Vimeo. O recém-laureado Nobel de Química quer que o novo sistema seja amplamente usado e experimentado, mesmo que ainda esteja em desenvolvimento. Chen, Legant e Wang estão trabalhando com trinta equipes de biólogos para descobrir melhores aplicações do novo aparelho. “Sabemos o que ele pode oferecer em termos de imagem, mas acho que há um monte de aplicações para as quais não pensamos”, conclui Legant.

A equipe já construiu um segundo microscópio para o Janelia Advanced Imaging Center — onde estará disponível gratuitamente aos cientistas visitantes (mais informações sobre essa disponibilidade aqui). Outros dois novos microscópios foram enviados para laboratórios em Harvard e na Universidade da Califórnia, em São Francisco.

REFERÊNCIA

rb2_large_gray25CHEN, Bi-Chang et. al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science 24 October 2014: Vol. 346 no. 6208 DOI: 10.1126/science.1257998
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