O assassinato de “P. aeruginosa” pela “E. coli” suicida
Uma nova e promissora área da biologia que vem sendo muito falada ultimamente é a “biologia sintética” que procura construir sistemas biológicos geneticamente modificados capazes de desempenhar funções novas – inexistentes – na natureza. Suas aplicações permeiam a produção de drogas e biocombustíveis, a degradação de contaminantes aquáticos e mesmo a morte de células cancerosas. Apesar de a utilização de micro-organismos ser freqüente nesse tipo de abordagem, ela ainda não foi explorada como estratégia de combate a doenças infecciosas. O argumento é sempre o mesmo – o que não significa que seja, por isso, menos válido: a estagnação na descoberta/desenvolvimento de novos antibióticos e a emergência dos patógenos multidrogas-resistentes criam um campo de busca e desenvolvimento de novas abordagens contra microrganismos patogênicos. Algumas abordagens já comentei por aqui: probióticos, transplante fecal e o plasma frio .
Nesse experimento, a bactéria-pau-pra-toda-obra-modelo Escherichia coli foi “engenheirada” e utilizada para matar, especificamente, células de Pseudomonas aeruginosa.
P. aeruginosa é um patógeno oportunista dos tratos respiratório e gastrintestinal, e infecções por esses micro-organismos podem ser fatais, principalmente para indivíduos imunocomprometidos. Além disso, essa bactéria é danadinha e possui mecanismos eficientes de efluxo de drogas, o que as tornam naturalmente resistentes a diversos antimicrobianos.
Foi num laboratório de uma universidade em Singapura, que Saeidi, Wong e colaboradores desenharam e construíram uma linhagem de E. coli capaz de perceber a presença de P. aeruginosa e, como resposta, liberar um peptídeo antimicrobiano.
Vamos analisar detalhadamente o modo isso foi feito…
A E. coli produz uma proteína denominada LasR capaz de reconhecer moléculas (30C12HSL - homoseril lactona) utilizadas na comunicação (quorum sensing – saiba mais clicando aqui) entre as células de pseudomonas. Quando LasR reconhece esses sinais químicos, ela se liga a dois genes (verde e amarelo). O primeiro (verde) arma a bomba – pois ele codifica a piocina, que mata P. aeruginosa causando perfuração na parede e extravasamento do conteúdo interno da célula. O segundo (amarelo) detona a bomba – ele produz a proteína Lysis E7 que rompe a célula de E. coli, matando-a e, ao mesmo tempo, lançando no ambiente a grande quantidade de piocina acumulada.
Na foto da esquerda vemos células intactas da “E. coli - bomba”, apesar de não ser possível ver, esses micro-organismos produzem constitutivamente moléculas de LasR. Quando estimuladas com a HSL, o pavio é aceso, a LasR reconhece a HSL e ativa a produção da piocina e das proteínas de lise – é isso que vemos na foto da direita, onde vemos as E. coli em diferentes estágios de lise.
Nessa figura vemos a ação da “E. coli bomba” sobre o biofilme de P. aeruginosa. à esquerda vemos (em verde) a película forma pelas células de pseudomonas, o gráfico mostra a espessura dessa formação. Porém, após a introdução da “bomba” vemos uma significativa redução do biofilme. Observe na foto e no gráfico à direita a diminuição da quantidade de bactérias e da espessura do filme bacteriano.
Legal, não é?
Então já poderemos logo logo encontrar essas bactérias na farmácia mais próxima de casa, certo?
Não… não é bem assim que as coisas funcionam. Apesar do sucesso de redução de 90% do filme bacteriano, muita coisa ainda tem que ser feita para se estabelecer a técnica e garantir a segurança de seu uso (aqui entram, ainda, os testes em animais). Inclusive, devemos considerar o fato da E. coli ser uma bactéria Gram-negativo e possuir, em sua parede, um componente denominado lipopolissacarídeo (LPS). Conhecido, também, como endotoxina, o LPS é liberado no momento da lise é pode causar efeitos sistêmicos no hospedeiro, como febre – e dependendo da concentração pode causar morte. Além disso, um outro incoveniente está relacionado ao crescimento mais lento (cerca de 3 vezes) que a bacteria modificada apresenta. Isso se deve, provavelmente, à inserção do plasmídio que deve ser replicado, além da produção constitutiva de LasR.
Assim, acho que, no momento, mais do que o fato de a bactéria ser capaz de matar a outra, o grande avanço demonstrado por este trabalho é a possibilidade de se modificar um microrganismo programado para responder de forma determinada a estímulos específicos e predeterminado pelos cientistas.
BIBLIOGRAFIA
Saeidi, N., Wong, C., Lo, T., Nguyen, H., Ling, H., Leong, S., Poh, C., & Chang, M. (2011). Engineering microbes to sense and eradicate Pseudomonas aeruginosa, a human pathogen Molecular Systems Biology, 7 DOI: 10.1038/msb.2011.55
Minhas impressões: 26o Congresso de Microbiologia – parte 1
Entre os dias 02 a 06 de outubro, na cidade de Foz do Iguaçu/PR, aconteceu o 26o Congresso Brasileiro de Microbiologia (CBM), organizado pela Sociedade Brasileira de Microbiologia (SBM). Esse é o maior congresso de microbiologia do Brasil, pois abrange as mais diversas áreas/subdivisões, e participam não só os grandes nomes da microbiologia no Brasil como do mundo.
Acho que sem sombra de dúvidas, a comparação entre este e o último CBM (que ocorreu em 2009 em Porto de Galinhas) é inevitável. Desde que entrei no laboratório em 2007 ouço comentários não muito favoráveis ao CBM, principalmente em relação às palestras ruins – mesmo assim resolvi ir ao CBM de 2009. Naquele ano, a grande decepção porém não se restringiu às palestras, mas expandiu-se por toda a organização. Começou na festa de abertura (que teve um show latino excelente, mas) que deixou muito a desejar nos comes e bebes. E isso também prosseguiu com a falta de coffee break e, principalmente, de água. Estávamos isolados do mundo, num calor infernal, e não tínhamos nem água pra beber. Neste ano isso foi resolvido. Além de um coffee break farto e gostoso, tivemos também almoço incluso – e, muito bom por sinal!! Um meeting point grande e com wifi grátis! A minha grande reclamação diz respeito ao último dia do congresso, que consistia apenas do Simpósio de Bactérias Láticas, e os participantes não tiveram direito a almoço e transporte ao final. A organização alegou que o simpósio e o congresso eram eventos distintos e independentes…
Junto ao congresso, aconteceram quatro eventos paralelos: ISME – Simpósio Internacional de Microbiologia Ambiental (América Latina), ENAPROM – Encontro Nacional de Professores de Microbiologia, Simpósio de Coleções de Cultura e o Simpósio de Bactérias Láticas. Eu participei basicamente do ISME, do Simpósio de Bactérias Láticas e assisti algumas palestras da área de relação parasito hospedeiro. ”
Algumas considerações
- O congresso teve em sua abertura a assinatura do acordo entre a SBM e outras sociedades com o propósito de se unirem para uma discussão e o desenvolvimento de métodos para a determinação de resistência bacteriana a antibióticos – que hoje seguimos padrões e valores americanos. Isso permite uma prática mais aplicada a nossa realidade e é um grande passo para a clínica brasileira.
- A palestra de abertura, “Martians, dinosaurs and mammals: Nihilistic thoughts on the origin of microbial virulence”, foi ministrada pelo prof. Casadevall que tem mais de 500 artigos publicados (mais de 35 artigos por ano, nos últimos anos!!). Achei que seria uma palestra que tenderia para o lado filosófico da coisa, mas o que o professor discutiu foram os mecanismos de patogenicidade dos fungos. E onde entram os marcianos, os dinossauros e os mamíferos aí no meio. Bom, não foi no meio, mas nos últimos 5 minutos da palestra. Os argumentos seriam:
1) MARCIANOS – que os fungos possuem uma gama variada de mecanismos de patogenicidade que os permitiram infectar mesmo um ET que por acaso viesse parar aqui na Terra.
2) DINOSSAUROS – o professor argumentou que os dinossauros, teriam sido extintos (em parte) por possíveis infecções fúngicas que teriam acontecido durante o resfriamento da Terra após a queda do asteróide.
3) MAMÍFEROS – ascensão dos mamíferos após a era dos dinossauros poderia estar associada a temperatura elevada do corpo o que dificultaria o desenvolvimento de micoses sistêmicas.
Tive alguma dificuldade em compreender o inglês do professor e, por isso, não sei os argumentos mais específicos. Além disso, o Roberto Takata – quando eu comentei sobre isso no twitter – levantou algumas questões bastante pertinentes: Apesar de os dinos terem se extinguido, outros grupos de répteis continuam aí firmes e fortes, e que existem indícios de que os dinossauros provavelmente possuíam temperaturas mais elevadas.
- Outro ponto que me chamou muito a atenção foi o estudo do microbioma. Por microbioma entendemos a identificação dos micro-organismos que vivem num determinado ambiente por meio de técnicas de biologia molecular. A grande vantagem é que, assim, mesmo os micróbios que não são cultiváveis podem ser identificados. Ë importante ressaltar que apesar de ouvirmos muito esse termo relacionado ao projeto microbioma humano, a busca por identificar as bactérias incluem aquelas que vivem no solo e nas águas, por exemplo. Há também grande interesse em descrever as funções de cada um desses organismos.
- As interações microrganismo-microrganismo, bem como as microrganismo-hospedeiro também têm ganhado grande apelo com as novas técnicas de biologia molecular e o avanço do microbioma. Nesse ponto podemos citar o papel dos microrganismos no desenvolvimento de doenças inflamatórias intestinais, obesidade e mesmo na regulação do sistema imune. Quando falamos de microbiologia ambiental, ressalto aqui o trabalho da profa. Leda Hagler (UFRJ) que trabalha na busca de microrganismos para serem utilizados na biorremediação de plantas de mangues contaminados.
- Estudos que permitam um melhor uso de bactérias probióticas em escala industrial também estão sendo bastante visados: linhagens que resistam a diferentes técnicas de processamento, que resistam por mais tempo nas prateleiras… e tudo isso sem perder suas propriedades.
Enfim, tem muita pesquisa boa e aplicada sendo realizada por aí…
Quero só falar de mais um dos momentos que presenciei. Um momento bem tenso por sinal: O pesquisador Jean-Marc Chatel (INRA/França) comentou na sua palestra sobre o uso de células Caco-2 (linhagem de células cancerosas) na sua pesquisa de interação microrganismo-hospedeiro. No momento das perguntas, a profa. Avrelija Cencic (University of Maribor/Eslovênia) levantou questionamentos se esse seria o melhor modelo, uma vez que a fisiologia dessas células é muito distinta das células normais. A partir de então, iniciou-se um bate-boca que terminou com Chatel soltando a seguinte frase: “Se eu estou fazendo errado, tem milhares de pesquisadores que também estão”. Bela forma de se terminar um discussão acadêmica, certo? Não.
Fechei esse congresso com uma visão bem positiva – e estou esperando o próximo em 2013 já com ansiedade! (espero que até lá eu tenha melhorado meu listening e que os palestrantes tenham melhorado o inglês falado!)
O que não me mata me faz mais forte? – IV: mecanismos de recombinação (parte 2)
No post anterior comentei sobre os processos I (transdução) e III (transformação) representados nesta figura do vestibular da UFMG/2008:
::: Conjugação
Uma forma que, para nós, seria um pouco mais “convencional” de troca de genes em bactérias é a chamada conjugação (processo II na figura acima). Esse é um processo de mão única, ou seja, o material genético é transferido da bactéria doadora para a bactéria receptora. Esse processo, portanto, envolve a participação de duas células vivas e requer contato entre elas.
Acontece, porém, que nem todas as bactérias estão aptas a executarem a conjugação. Na verdade, a maioria não está. Para que a célula esteja apta a conjugar, ela deve ter um plasmídeo conjugativo – os chamados plasmídeos F (de fertilidade). A bactéria doadora é também chamada de F+ (devido à presença do plasmídeo F) ou de “macho” – em uma terminologia que está incorreta e cada vez mais em desuso. A bactéria receptora por sua vez, é chamada de F- ou de “fêmea”.
Plasmídeos são pequenas moléculas circulares de DNA, capazes de se replicarem independentemente do DNA cromossômico. Essas estruturas geralmente não possuem genes essenciais, mas genes que conferem alguma vantagem ao microrganismo, como, por exemplo, capacidade de conjugar, ou resistência a antibióticos ou, ainda, capacidade de metabolizar diferentes substratos.
Na figura abaixo (Sadava et al, 2009), vemos a esquematização desse processo. Observe que a bactéria doadora é a bactéria da esquerda pois é ela quem possui os plasmídeos F (representados como círculos vermelhos) e que esses plasmídeos é que são o material genético transferido de uma bactéria para a outra. Ao final do processo, a bactéria receptora, passa a portar o plasmídeo F, tornando-se capaz de atuar como uma bactéria doadora em um outro processo de conjugação.
O mais comum é que apenas plasmídeos sejam transferidos nesses processos. Algumas vezes, porém, o plasmídeo integra-se ao DNA cromossômico da célula. Nesses casos, genes cromossomais podem acabar sendo transferidos. Como esse é um processo lento e a ponte de ligação entre as bactérias é frágil, geralmente, apenas alguns genes são transferidos, uma vez que o cromossomo bacteriano é muito grande.
A transferência do material genético ocorre a partir de um ponto específico que chamamos de “origem de replicação”. Assim, quanto mais próximo um gene está da origem de replicação, maior a chance dele ser transferido para outra bactéria. A descoberta desse mecanismo permitiu que os cientistas fizessem o mapeamento dos genes da Escherichia coli. Em outras palavras: quanto mais longe o gene está da origem de replicação, mais tempo ele demora para ser transferido. Observe a figura abaixo (Griffiths, 2009):
Neste esquema, o plasmídeo (vermelho) está inserido no cromossomo (azul). A origem de replicação, local onde se inicia a transferência do DNA, está representada por uma cabeça de seta vermelha. Para entendermos como isso funciona, é como se uma tesoura cortasse logo à frente da cabeça da seta, e alguém viesse puxando o fiozinho de DNA. Assim, os genes são transmitidos em ordem: gene roxo, gene azul claro, gene amarelo, gene verde e para e para terminar, o resto do plasmídeo (em vermelho). Observe que está marcado o tempo transcorrido a cada etapa. Na primeira etapa, 10 minutos, apenas os genes roxo e azul claro foram transferidos, e o gene amarelo está no meio do tubo conjugativo. Aos 17 minutos, o gene amarelo está no finalzinho da ponte de conjugação. Por fim, aos 25 minutos, o gene amarelo já chegou à bactéria receptora e o gene verde está na metade do caminho.
::: Transposição
Transposons são sequências específicas de DNA que podem mover-se de uma posição no cromossomo para uma posição diferente em um mesmo cromossomo ou em um cromossomo diferente. No caso das bactérias, um transposon pode “pular” do cromossomo bacteriano para outro ponto nesse cromossomo ou para um plasmídeo; ou então pode pular do plasmídeo para um outro lugar nesse mesmo plasmídeo, para outro plasmídeo, ou para o cromossomo bacteriano. Assim, um único plasmídeo R (de resistência) pode ter diferentes transposons com genes de resistência, como nos mostra a figura do livro Introdução à genética. (Griffiths, 2009):
Aqui observamos 4 diferentes transposons, identificados por: Tn3, Tn4, Tn5 e Tn10. O Tn3 confere resistência à ampicilina (amp). O Tn4 confere resistência à estreptomicina (sm), sulfonamida (su), mercúrico (Hg), além de conter o Tn3. O Tn5 porta genes de resistência à canamicina (kan); e o Tn10 à tetraciclina (tet). O plasmídeo ainda possui um gene de resistência ao cloranfenicol (cm).
Como os transposons podem pular entre plasmídeos, eles podem acabar sendo transferido entre bactérias por meio da conjugação, ajudando ainda mais no processo de resistência.
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SAIBA MAIS
Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, Clark DP (2010) Microbiologia de Brock. 12 ed. Porto Alegre: Artmed
Sadava D, Heller HC, Orians GH, Purves WK, Hillis DM (2009) Vida. Vol 1. 8 ed. Porto Alegre: Artmed.
Griffiths A, Wessler S, Lewontin R, Carrol S (2009) Introdução à genética. 9 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan.
Schaechter M, Engleberg NC, Eisenstein BI, Medoff G (2002) Microbiologia – Mecanismo das doenças infecciosas. 3 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan.
O que não me mata me faz mais forte? – III: mecanismos de recombinação (parte 1)
Num post antigo, falamos num dos princípios básicos da evolução: a existência de variabilidade entre os indivíduos de uma população. Essa variabilidade tem sua origem, primariamente, na mutação do material genético. A mutação pode não causar nada ou, até mesmo, causar a morte do mutante. Porém, caso a mutação provoque alguma alteração fenotípica que permita que indivíduo mutante deixe mais descendentes que os “normais”, está havendo ali a seleção natural a favor desta nova característica.
Essa variabilidade, por outro lado, pode ser ampliada por processos de recombinação gênica. Quando falamos em procariotos, temos que entender que eles, ao contrário de nós, não realizam reprodução sexuada. A reprodução sexuada pressupõe meiose, e a divisão binária procariótica é um processo mitótico. Na falta do sexo, as bactérias utilizam outros mecanismos para promoverem essa recombinação. Esses processos são quatro: I) transdução; II) conjugação; III) transformação e IV) transposição. Os mecanismos I, II e III estão esquematizados na figura abaixo (do vestibular UFMG/2008).
Tendo apresentado brevemente os mecanismos, quero ressaltar que ao contrario do que estamos acostumados, a recombinação genética em procariotos ocorre de maneira bastante promíscua. Não digo somente entre diversos indivíduos de uma mesma espécie, mas entre indivíduos de espécies e, até mesmo, gêneros diferentes.
::: Transformação
Neste processo, o DNA livre de uma bactéria morta é incorporado em uma célula receptora. Mas para que essa absorção ocorra a bactéria deve ser competente (ou transformável). Dentre as bactérias naturalmente competentes estão espécies de Acinetobacter, Bacillus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria e Thermus. Em laboratório podemos forçar essa competência através de processos elétricos, térmicos ou químicos. Observe na figura abaixo [retirada de Sadava et al (2009)] com mais detalhes.
A descoberta da transformação bacteriana é relativamente recente e foi um dos experimentos que levou à identificação do DNA como o material genético.
No final da década de 20, o cientista inglês Frederick Griffth realizava pesquisas com o peneumococo. A forma virulenta do pneumococo (Streptococcus pneumoniae) é encapsulada por uma cobertura gelatinosa que impede que nossas células de defesa a reconheça e a destrua. Pneumococos mutantes que não possuem essa cápsula não são patogênicos. Os pneumococos virulentos são conhecidos como forma S e os não virulentos como forma R, devido às aparências lisa (smooth) e rugosa (rough) de suas colônias em cultura. Em 1928, Griffith fez uma descoberta surpreendente. Ao injetar em camundongos uma mistura de pneumococos R vivos e S mortos pelo calor, o experimento resultou na morte da maioria dos camundongos. Mais surpreendente foi o fato de o sangue dos camundongos mortos conter pneumococos S vivos. Veja o esquema abaixo [retirada de Sadava et al (2009)]
Assim, Griffith concluiu que as células R haviam sido transformadas em um novo tipo. Experimentos posteriores foram feitos para se descobrir qual seria a substância responsável para transformação. Assim, nas décadas de 30 e 40, um outro pesquisador – Avery – e seus colaboradores identificaram essa substância como o DNA.
Atualização: O Gabriel Cunha do blog Ciensinando, fez uma série de posts sobre a descoberta do DNA. No segundo post da série, ele comenta sobre os experimentos de Griffith. Dê uma olhadinha, clicando AQUI!
::: Transdução
Neste processo há a participação de um outro microrganismo, um bacteriófago (vírus bacteriano). Neste caso, no processo de infecção do fago, ocorre o empacotamento de parte do DNA bacteriano. O vírus passa, então, a carregar no seu genoma genes bacterianos. Assim, ao infectar uma nova célula, esse material genético é introduzido e a bactéria pode incorporar esses genes ao seu genoma. Observe abaixo o esquema deste processo [retirado de Sadava et al (2009)].
Assim como na transformação, nem todos os procariotos são transduzíveis, nem todos os fagos são transdutores. Acredita-se, porém, que o fenômeno é suficientemente disseminado, de forma que, provavelmente, desempenhe um importante papel na transferência de genes na natureza.
::: Como o post já está grande demais, vou deixar para falar sobre a conjugação e a transposição no quarto post da série. Veja AQUI!!
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SAIBA MAIS
Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, Clark DP (2010) Microbiologia de Brock. 12 ed. Porto Alegre: Artmed
Brooks GF, Carroll KC, Butel JS, Morse AS (2009) Jawetz, Melnick e Adelberg: Microbiologia Médica. 24 ed. Rio de Janeiro: McGraw-Hill
Sadava D, Heller HC, Orians GH, Purves WK, Hillis DM (2009) Vida. Vol 1. 8 ed. Porto Alegre: Artmed.
O antibiótico não funcionou? Que tal tentar o plasma frio!?
Os infectologistas vêm encotrando grandes desafios no dia a dia da prática médica… são as bactérias multi-drogas resistentes. Muitas dessas bactérias recebem uma sigla como identificação. Temos, como exemplo: 1) o Staphylococcus aureus resistente à meticilina, o MRSA (Methicilin Resistent S. aureus); 2) Enterococcus faecalis resistente à vancomicina, o VRE (Vancomicin Resistent E. faecalis); e mais recentemente 3) a Klebsiella pneumoniae produtora de KPC (KPC é uma enzima inativadora de antibióticos do tipo carbapenemase). Além de diferentes mecanismos para que essa resistência seja efetiva, muitas dessas bactérias crescem em biofilmes, o que dificulta a chegada do antibiótico à células bacterianas, sendo um outro mecanismo de patogenicidade relacionado à resistencia aos antibioticos.
Uma das grandes apostas nas pesquisas em microbiologia é a busca de novas formas de controle de microrganismos. Essas pesquisas variam de métodos químicos como a busca por novos fármacos, a métodos microbiológicos, como, por exemplo, os probióticos. Nesse contexto de busca de novos tratamentos, uma equipe de colaboradores russos e germânicos propuseram uma técnica física muito curiosa que envolve a utilização de plasma frio.
Primeiro, observe a imagem abaixo. A placa da direita (“original”) é uma placa de ágar Sangue, mostrada na foto em seu aspecto original e está sendo utilizada como um controle. A placa da esquerda (“plasma-treated”), mostra uma placa de ágar Sangue, na qual foi feita uma cultura de Staphylococcus aureus e posteriormente um tratamento com o plasma frio.
Observe que na região onde houve contato com o jato de plasma a baixas temperaturas, houve a formação de uma área onde 99% das bactérias foram mortas (indicado por um circulo na figura da esquerda). As áreas mais claras ao redor das colônias bacterianas, indicam que a bactéria é produtora de uma enzima que provoca hemólise, ou seja, destroem as hemáceas do sangue.
Dois outros pontos que chamam muito a atenção são;
1) Esse tratamento parece ser capaz de matar as bactérias que formam biofilmes. Biofilmes mais espessos ainda apresentam algum nível de resistência. Biofilmes são aglomerados polimicrobianos, envoltos em uma matriz gelatinosa que podem aumentar a resistencia das bactérias à antibióticos em até 1000 vezes quando comparadas às bactérias livres.
2) Quando foram realizados testes em animais, nos quais foram feitas feridas e, posteriormente, infecção com Pseudomonas aeruginosa ou Staphylococcus aureus, após um tratamento de 5 minutos, até 90% das bactérias foram mortas. Isso, sem denos aos tecidos animais e, ainda, aumentando a taxa de cicatrização dessas feridas. O que indicaria que o efeito bacteridida do plasma interfere apenas no DNA e nas estruturas de superfície bacterianas.
Mas o que seria esse plama frio?
O plasma é considerado o quarto estado da matéria… Ele é obtido ao aquecermos um gás a elevadas temperaturas. Mas são temperaturas tão elevadas, acima de 10.000 °C, que a estrutura atômica é desfeita. Leia com mais detalhes aqui e aqui.
Mas como aplicar um plasma em um tecido humano? O plasma aplicado pelos cientistas possuia um fração pequena de partículas ionizadas. Assim, o calor é distribuído entre as moléculas ionizadas e não-ionizadas, permitindo aos cientistas manter o plasma à temperatura de aproximadamente 35-40 °C (o chamado plasma frio) para realizar o tratamento.
A grande aposta dos cientistas nesse tratamento, seria a possibilidade da utilização desta abordagem terapêutica, que é muito específica, no caso de os outros métodos falharem e pelo fato de se tratar de uma metodologia cujo desenvolvimento de uma resistência microbiana seria muito difícil. Além de ser um tratamento que não envolve contato, que é indolor e não contribui com a contaminação química do ambiente.
O artigo original é este:
- S. Ermolaeva, et al. Bactericidal effects of nonthermal argon plasma in vitro, in biofilms and in the animal model of infected wounds. Journal of Medical Microbiology, 2010; DOI: 10.1099/jmm.0.020263-0
Mas como não consegui o acesso, o post foi escrito com as informações contidas nestes links:
Vilões da resistência: antibióticos e antissépticos [do Gene Repórter]
Essa é uma repostagem integral do post homônimo do blogue “Gene Repórter” do Roberto Takata!
Esta postagem é um adendo à excelente feita por Karl do Ecce Medicus: KPC, sabonetes e bactérias irresistíveis.
Uma diferença prática entre antibióticos e antissépticos é que os primeiros têm uso sistêmico (são ingeridos, injetados, administrados de modo que sejam absorvidos e atuem *dentro* do nosso organismo – ou de animais que queremos tratar) e os segundos, uso tópico (são aplicados na parte externa do corpo – mucosa da boca, ferimentos, pele…). (Há antibióticos tópicos, mas são usados em casos bem específicos, como em certos curativos de queimaduras, tratamento de conjuntivite purulenta ou eczema superinfectado.) Ambos têm ação restrita a micro-organismos – não têm a função de combater vírus.
Muitas vezes os antibióticos atuam sobre a maquinaria celular básica – e como há similaridades com a nossa própria maquinaria celular, os antibióticos podem ter ação sobre nós também. Então, procura-se utilizar compostos que tenham efeitos sobre os micro-organismos em pequenas doses.
Nosso corpo apresenta uma barreira natural – como a nossa pele – contra a invasão de agentes externos. Essa barreira faz com que os antissépticos tenham uma ação limitada sobre nosso organismo, de modo que muitas vezes são usados em concentrações muito maiores.
P.e., a penicilina administrada para um humano adulto é algo em torno de 0,93 g. Espalhando-se pelo organismo dá uma concentração de cerca de 1,3.10-2 g/kg (0,0013% em massa).
Sabonetes com triclosano (composto antisséptico usado desde os anos 1970, mas cujo mecanismo de ação molecular sócomeçou a ser desvendado em 1999) podem ter concentração de até 1% (g/ml) – sabonete cirúrgico -, sabonetes antissépticos mais comuns têm concentração de 0,5%. Em desodorantes, o triclosano é usando em concentrações de 0,1%.
Há registros de linhagens resistentes ao triclosano. Mas não há tantos problemas como em relação às linhagens resistentes aos antibióticos. Por quê? Por vários motivos.
Como dito sobre antissépticos, seu uso é *externo*. Ou seja, esses micro-organismos resistentes estão *fora* do corpo. O grande problema é quando micro-organismos resistentes a tratamento estão *dentro*. Como no caso de micro-organismos resistentes a antibióticos, em condições normais, as linhagens resistentes a antissépticos são *menos* bem adaptados do que linhagens não-resistentes em um ambiente sem o agente seletivo (o antisséptico ou o antibiótico) – isso porque o antisséptico ou o antibiótico muitas vezes atua sobre o metabolismo ou estrutura do micro-organismo, e a resistência ocorre normalmente pela alteração no metabolismo ou estrutura. Quando o agente seletivo não está presente, temos a situação anterior – para as quais as linhagens não-resistentes já estavam adaptadas; quase sempre a alteração presente nas linhagens resistentes não trabalha bem nessas condições sem o agente seletivo – até por isso estão presentes em muito menor número (se estão). (Não é exatamente correto falar em “sem agente seletivo”, o que ocorre é que a situação de seleção se altera.)
Pensemos, então, no caso dos antibióticos. A infecção se instala, é administrado o antibiótico. Linhagens resistentes proliferam. Quando se para de administrar o antibiótico, leva um tempo até que ele seja eliminado. A linhagem resistente continua a proliferar. Assim que o antibiótico é eliminado pelo organismo (é metabolizado e/ou eliminado pelas excreções), as linhagens não-resistentes passam a proliferar. Ou seja, o paciente fica em um quadro permanente de infecção. Esse é o problema.
Analisemos o caso dos antissépticos. Na nossa vida cotidiana, sem trabalhar em ambiente hospitalar ou em laboratórios de microbiologia, estamos em contato permanente com micro-organismos. Na maior parte do tempo, eles não fazem mal. Ou porque sua biologia não é patogênica, ou porque as nossas defesas dão conta. O uso de antissépticos apenas diminui – por um momento – a quantidade deles em partes (externas) de nosso corpo: diminuindo – por um momento – a probabilidade de infecções oportunistas. Na verdade, apenas o uso de sabonetes comuns já remove – por um momento – uma boa quantidade de micro-organismos do local lavado; sabonetes antissépticos apenas aumentam um pouco mais a quantidade removida. Mas o que acontece com as linhagens resistentes? Bem, o contato com antissépticos é apenas momentâneo – lavamos, a maior parte dos micro-organismos é removida, restando os poucos resistentes. Só que nosso corpo está em permanente contato com o ambiente, linhagens não-resistentes voltam e, normalmente, superam as linhagens resistentes. Na próxima lavagem, a maior parte das linhagens não-resistentes é removida, restando os poucos resistentes. As linhagens resistentes não levam muita vantagem nessa situação.
Não há motivo, portanto, de paranoia com os produtos de higiente que contêm antissépticos. (E como alerta Karl no Ecce Medicus, produtos de higiene com antibióticos são proibidos.)
Eu apenas acho que é desperdício de dinheiro comprar sabonetes antissépticos salvo em condições muito especiais – como recomendação médica (por exemplo, a pessoa tiver feridas na pele).
KPC, Sabonetes e as Bactérias Irresistíveis [do "Ecce Medicus"]
Essa é uma repostagem integral e autorizada do post homônimo do blogue “Ecce Medicus” do Karl, no portal do SbBr.
Chegando atrasado de novo… Levei cravada dos leitores, dos colegas do Scienceblogs, da minha mãe… Vamos tentar dar uma organizada na confusão que se instalou no Twitter, na mídia e na minha casa. Vai ser meio longo, então vamos direto ao assunto.
Bom, em primeiro lugar vamos falar de antibióticos ou, mais precisamente, agentes antimicrobianos (vamos usar antibiótico, mesmo). Um antibiótico é uma substância produzida por algumas espécies de microorganismos (bactérias, fungos e actinomicetos) que suprimem o crescimento de outros microorganismos. Normalmente, estendemos a terminologia para antimicrobianos sintéticos como sulfas e quinolonas. Existem trocentos tipos de antibióticos e várias classificações já foram propostas para organizar a confusão. Todas têm imprecisões. A mais utilizada é a que leva em consideração a estrutura química e o mecanismo de ação, e isso nos interessará mais pra frente.
1. Agentes que inibem a síntese da parede celular de bactérias. Aqui podemos incluir as penicilinas (Benzetacil), cefalosporinas (cefalexina, Keflex, etc), a vancomicina (um antibiótico ruim mas extremamente útil) e os antifúngicos chamados azólicos muito utilizados como o fluconazol.
2. Agentes que agem diretamente na membrana celular do microorganismo. (Você pode estar achando que membrana e parede são a mesma coisa, né? Mas, não são. A figura abaixo [clique para aumentar], mostra diferenças entre as bactérias Gram positivas e Gram negativas, uma classificação de microorganismos muito utilizada na clínica. Ela se baseia na coloração que as bactérias assumem com determinado corante [Gram]. Isso ocorre porque as bactérias têm uma composição da parede diferente como pode ser visto na figura. As gram positivas têm uma parede celular grossa e uma membrana celular. As gram negativas têm uma membrana celular dupla com uma parede celular fininha no meio, como um sanduíche.) Esses agentes possibilitam uma lesão osmótica no microorganismo. Como exemplo, temos os antifúngicos polimixina, nistatina.
3. Agentes que causam inibição da síntese proteica (ligação às subunidades ribossômicas 30S e 50S). Por exemplo, o velho cloranfenicol, clindamicina.
4. Agentes que modificam a síntese proteica (ligação à subunidade 30S). Exemplo: aminoglicosídeos (a famosa gentamicina).
5. Agentes que afetam o metabolismos dos ácidos nucleicos. Rifampicinas e as quinolonas (exemplo, o Cipro e a norfloxacina).
6. Antimetabólitos que bloqueiam enzimas essenciais do metabolismo do folato, por exemplo, o Bactrin.
7. São os agentes antivirais. Não vou falar deles neste post.
Perdemos bastante tempo para mostrar que os antibióticos agem de maneiras muito diferentes. As bactérias espertamente, desenvolvem vários mecanismos para combater essas ameaças. São, também, mecanismos bastante específicos e há muita gente estudando isso pelo seríssimo problema que bactérias multirresistentes têm causado.
Recentemente houve uma enxurrada notícias, um pouco alarmantes até, sobre uma superbactéria “chamada” KPC. Em primeiro lugar KPC não é uma bactéria. É uma sigla que deu nome a uma enzima inativadora de antibióticos: Klebsiella pneumoniae carbapenemase. Médico não é muito bom para dar nome, mas esse saiu porque a tal enzima foi encontrada nessa bactéria (a klebsiella) e acabou ficando. O quadro abaixo mostra as enzimas inativadoras de antibióticos chamados beta-lactâmicos isoladas. Os beta-lactâmicos incluem todas as penicilinas, sintéticas e semi-sintéticas bem como os carbapenêmicos. Estes últimos, têm sido considerados antimicrobianos de última linha, pois têm espectro bastante amplo e são reservadas para casos graves e/ou que necessitam de intervenções rápidas.
Como podemos notar, a KPC (ver a seta vermelha) é um tipo de carbapenemase que inativa TODOS os beta-lactâmicos o que é bem preocupante. Mas, ela não está sozinha. Temos a GES, a SME, as carbapenemases classe D (OXA-48, -23, -24, -58) e as Metaloproteinases (classe B). Estamos vivendo um surto de KPCs no HCFMUSP desde o início de 2010. Há possibilidades terapêuticas, mas são exíguas, de antibióticos mais tóxicos que os carbapenêmicos e de difícil administração em pacientes graves; ou seja, estamos longe de uma condição confortável, mas não estamos em PÂNICO. Temos lidado com resistências bacteriana desde a invenção do antibiótico. Confesso que os tempos de hoje não estão fáceis. Medidas cada vez mais restritivas têm sido tomadas pelas comissões de infecção hospitalar no sentido de controlar os surtos.
É muito importante dizer que as bactérias portadoras dessas enzimas não são “mais fortes” que as bactérias sensíveis a antibióticos comuns. Muito pelo contrário! Bactérias “da rua”, em geral, são mais agressivas e suplantam suas amigas hospitalares. As bactérias resistentes aos antibióticos só conseguem viver no meio hospitalar, onde os antibióticos são utilizados e matam as bobinhas permitindo apenas às resistentes sobreviver. Por isso, nossa flora bacteriana normal é eficaz em nos proteger de infecções patogênicas, em especial, as multirresistentes.
Posto isso, um cara, talvez pegando carona na paranóia generalizada da mídia, resolveu escrever que alguns sabonetes têm antibiótico e que por isso, poderiam induzir resistência bacteriana. Ops, wrong way! Eu não conheço NENHUM sabonete com antibiótico. Os sabonetes contém antissépticos. Antissépticos são substâncias que geralmente não podem ser administradas aos seres humanos por serem extremamente tóxicas. Por isso, também são excelentes em matar qualquer ser vivo, bactérias incluso. São, por essa razão, chamados mais modernamente debiocidas. Os biocidas tornam o meio em que a bactéria vive inapropriado para sua reprodução e diminuem drasticamente o número de bactérias. Há alguns anos atrás, uma polêmica envolveu os biocidas: será que eles não poderiam também causar resistência bacteriana? Quem mais publicou isso foi um autor chamado Russell (ver abaixo). No artigo citado, ele escreve que uma cultura pode ser considerada resistente a um biocida quando não é inativada pela concentração em uso da substância ou pela concentração que normalmente inativa outras cepas. O conceito de “resistência bacteriana” não pode ser aplicado aos biocidas por isso, usa-se o termo “insuscetibilidade” ou “tolerância”, o primeiro sendo preferível. A figura ao lado mostra aspectos envolvidos na ação dos biocidas.
É possível “treinar” bactérias a serem insuscetíveis a biocidas cultivando-as em meios com pequenas concentrações de droga que podem ser aumentadas progressivamente. Em 2002, Levy (J Antimicrob Chemother 2002;49: 25–30) levantou a possibilidade de que o uso indiscriminado dos biocidas pudesse induzir insuscetibilidade e também resistência bacteriana, o que foi uma das teses do textos sobre os “sabonetes antibióticos”. Não há evidência de que isso possa ocorrer. Russell conclui seu artigo com essa frase: “Resistant bacteria were not seen in greater numbers in areas where biocides had been employed than in areas where they had not been used. When used correctly, biocides have had and will continue to have an important role in controlling infectious diseases.” (grifos meus).
Conclusões
1. KPC não é bactéria. É uma enzima que inativa potentes antibióticos. Estamos vivendo um surto de bactérias com essa enzima e isso não é bom. Ela não é a única enzima e outras notícias ruins poderão vir. Medidas severas estão sendo tomadas por orgãos competentes.
2. Eu não conheço sabonete com antibiótico. Se alguém descobrir algum, me avise que eu vou denunciar na ANVISA. Os sabonetes e liquidos desinfetantes têm antissépticos (biocidas).
3. Resistência aos biocidas é chamada de insuscetibilidade. Não há, até o momento, descrição de fenômenos de resistência bacteriana induzida por biocidas.
Bibliografia
1. Chambers, HF. Antimicrobial Agents. Goodman & Gilman’s – The Pharmacological Basis of Therapeutics. 5th ed. pag 1143.
2. Pfeifer, Y., Cullik, A., & Witte, W. (2010). Resistance to cephalosporins and carbapenems in Gram-negative bacterial pathogens International Journal of Medical Microbiology, 300 (6), 371-379 DOI: 10.1016/j.ijmm.2010.04.005
3. Russell AD (2003). Biocide use and antibiotic resistance: the relevance of laboratory findings to clinical and environmental situations. The Lancet infectious diseases, 3 (12), 794-803 PMID: 14652205
O que não me mata me faz mais forte? – Resistência, seleção e mutação em bactérias
Estava eu lendo o último livro de Richard Dawkins - “O maior espetáculo da Terra” (leia a resenha feita pelo Luis Bento, do “Discutindo Ecologia”, aqui) – quando me deparei com o seguinte trecho na página 130:
“Causou-me certa irritação ler um folheto, no consultório do meu médico, alertando sobre o perigo de parar de tomar comprimidos de antibiótico antes do tempo prescrito. Não há nada de errado no aviso em si, mas a justificativa apresentada preocupou-me. O folheto explica que as bactérias são ‘espertas’ e ‘aprendem’ a lidar com antibióticos. Presumivelmente os autores acharam que o fenômeno da resistência aos antibióticos seria mais fácil de entender se eles o chamassem de aprendizado em vez de seleção natural. Mas falar em esperteza e aprendizado para bactérias é confundir o público, e sobretudo não ajuda o paciente a compreender por que ele deve seguir a instrução de continuar tomando comprimidos até o fim. [...] Se entre as bactérias houver variação genética que torne mais suscetíveis ao antibiótico do que outras, uma dose intermediária será sob medida para uma seleção benéfica aos genes que favorecem a resistência.”.
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Esse trecho me fez lembrar de uma questão do Vestibular-2008 da UFMG, que trata justamente da questão da resistência das bactérias aos antibióticos. Resolvi, então, fazer uma série sobre resistência a antibacterianos; mas a falta de tempo que cai sobre mim este semestre tem me impedido de fazê-la. Porém, consegui fazer este post comentando alguns aspectos da questão a que me referi.
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Uma propriedade muito legal nas bactérias é sua capacidade de reprodução [assexuada- por fissão binária] extremamente rápida, atingindo populações extremamente numerosas em um tempo relativamente curto. Isso ocorre pois, além do curto tempo de geração (alguns minutos ou horas, geralmente), o crescimento é exponencial, onde uma bactéria origina sempre duas, e assim por diante. Dessa forma, em 8 gerações, a partir de uma única bactéria obteríamos 256 células (1 -> 2 -> 4 -> 8 -> 16 -> 32 -> 64 ->128 ->256…). Se o tempo necessário para a bactéria se dividir for de 30 minutos, essa quantidade seria obtida após 4 horas apenas…
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Saiba, porém, que quando vamos fazer uma cultura de bactérias, não colocamos apenas 1 célula, mas várias. E com essa multiplicação exponencial, após 24 horas, em um tubo de ensaio com 5 mL de meio de cultura líquido, conseguimos quantidades enormes como 5 bilhões de bactérias (cerca de 1 bilhão [109] de bactérias por mL). Impressionante, não?!
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É essa multiplicação rápida e constante permite não só a obtenção de muitos indivíduos em pouco tempo, mas também nos permite visualizar o processo de seleção natural mais facilmente do que em organismos que possuam uma reprodução mais lenta. E uma das formas mais comentadas de seleção em bactérias diz respeito à resistencia à antibacterianos/antibióticos.
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Abaixo, figura (do vestibular UFMG/2008), mostra bem a visão que normalmente se cria na população quando o assunto é resistência à antibióticos. Ela retoma bem o exemplo de Dawkins reproduzido acima. Segundo aquele exemplo, poderíamos interpretar a figura (INCORRETAMENTE – vale ressaltar) como uma população de bactérias que era sensível ao antibiótico ampicilina, até que, após a introdução do antibiótico, as bactérias usaram da sua esperteza para aprenderem a se tornarem resistentes ao antibiótico. Essa ideia retoma a ideia Lamarckista de evolução, no qual a evolução depende da vontade do organismo, levando-o à perfeição.
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A próxima figura (também do vestibular UFMG/2008), nos mostra uma visão mais realista do que acontece. A partir de uma população inicial, surgiu ali uma mutação que tornou parte das bactérias resistente ao antibiótico. Isso não conferiu, necessariamente, vantagem evolutiva para essas mutantes no período anterior à introdução da ampicilina – ou seja, elas se multiplicavam e conviviam com as não-resistentes… Foi então que o uso do antibiótico eliminou as bactérias sensíveis da população, garantindo vantagem reprodutiva para as bactérias resistentes. Essas, então, foram selecionadas, e passaram a reproduzir. A partir de então, a população das bactérias é constituída apenas de bactérias resistentes ao antibiótico.
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Falei ali no parágrafo acima que a bactéria tornou-se resistente porque sofreu uma mutação. Quando falamos em mutação temos que lembrar que este é um evento raro. A probabilidade “normal” de uma mutação ocorrer espontaneamente em um determinado gene de E. coli é de cerca 1 em 10 milhões (1×10-7) por divisão celular. Se considerarmos as cerca de 2×1010 novas células de E. coli que surgem a cada dia no intestino de uma pessoa, existirão cerca de (1×10-7) X (2×1010) = 2.000 bactérias com uma mutação neste gene. O número total de mutações quando todos os 4.300 genes de E.coli são considerados é de cerca de 2.000 X 4.300 = 9 milhões por dia em cada hospedeiro humano.
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Neste tubo de ensaio temos uma cultura de 6,5 mL de bactérias, logo temos cerca de 6.500.000.000 bactérias (6,5 bilhões é um número razoavelmente próximo do número de humanos no nosso planeta que deve estar próximo dos 7 bilhões). É como se neste tubo inteiro, apenas 650 bactérias tivessem a mutação em um determinado gene (considerando a taxa de 1/10 milhões).
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É obvio que no tubo existem diversas outras mutações, algumas com taxas um pouco maiores e outras, menores. Mas o que é importante notar é que esse evento é RARO, inclusive nas bactérias. O que acontece é que em pouco tempo conseguimos um grande número de gerações. Assim, o que na população humana (que tem gerações de ~25 anos) demoraria muitos e muitos anos para acontecer, acontece nos procariotos em um tempo muito curto.
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Veja este vídeo produzido na UFMG sobre resistência bacteriana a antibióticos.
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SAIBA MAIS
http://student.ccbcmd.edu/courses/bio141/lecguide/unit2/control/mutate.html
Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, Clark DP (2010) Microbiologia de Brock. 12 ed. Porto Alegre: Artmed
Brooks GF, Carroll KC, Butel JS, Morse AS (2009) Jawetz, Melnick e Adelberg: Microbiologia Médica. 24 ed. Rio de Janeiro: McGraw-Hill/Artmed
Campbell NA, Reece JB et al. (2010) Biologia. 8 ed. Porto Alegre: Artmed
