Problemas com PCR!

Após desenhar o seu primer,  montar a sua reação e programar o termociclador, você pode enfrentar problemas para otimizar as sua condições de PCR. Algumas simples ações podem resultar em um produto de PCR específico. Estas são as questões mais comuns aqui no laboratório:

1. Estou tendo (muitos) fragmentos inespecíficos maiores do que o esperado. O que fazer?

– Diminuir o tempo de anelamento da reação;

– Aumentar a temperatura de anelamento (aumento 2 graus a cada teste);

– Diminuir o tempo de extensão;

– Colocar menos primers;

– Checar e colocar menos DNA;

2. Estou obtendo fragmentos inespecíficos menores do que o esperado. O que fazer?

– Aumentar a temperatura de anelamento;

– Aumentar o tempo de anelamento;

– Aumentar a temperatura de extensão;

– Aumentar a temperatura de extensão para 74-78 oC;

– Colocar menos primers e/ou menos DNA.

3. A reação estava funcionando antes, mas agora eu não obtenho nenhum produto.

– Tenha certeza que todos os componentes estão na reação (tampão, DNA, primers…);

– Teste um novo Master Mix ou uma nova solução de dNTP (são sensíveis a descongelamentos consecutivos);

– Utilize um estoque novo de primers;

– Diminua sua temperatura de anelamento 6-10 oC, se não obtiver nenhum fragmento verifique todas os componentes.

Nos próximos posts vou comentar sobre técnicas de PCR: como RT-PCR, deleção de genes…

Related Posts Plugin for WordPress, Blogger...

Discussão - 4 comentários

  1. Manoel disse:

    Aparece um rastro acima e abaixo do da banda do amplificado, inclusive no controle negativo, embora nesse não há banda.

  2. Fabiola Faria disse:

    Estou com o mesmo problema do Manoel. Esses rastros podem ser por excesso de algum reagente?

  3. paula disse:

    Olá, estou com o mesmo problema dos colegas acima, aparece um arraste enorme em todos os pocinhos, ja troquei Taq, Master Mix, DNA e aumentei a temperatura e nada se resolveu.

  4. Dhemerson disse:

    Boa tarde, estou com o seguinte problema: a banda amplifica mais em algumas aparece rastro, e primer dimers e em outras não, além disso está formando amplicon com tamanho diferente, 680 pb (é o amplicon de interesse) e 615 pb, mas não há bandas inespecíficas.

Envie seu comentário

Seu e-mail não será divulgado. (*) Campos obrigatórios.

Sobre ScienceBlogs Brasil | Anuncie com ScienceBlogs Brasil | Política de Privacidade | Termos e Condições | Contato


ScienceBlogs por Seed Media Group. Group. ©2006-2011 Seed Media Group LLC. Todos direitos garantidos.


Páginas da Seed Media Group Seed Media Group | ScienceBlogs | SEEDMAGAZINE.COM