Problemas com PCR!

Após desenhar o seu primer,  montar a sua reação e programar o termociclador, você pode enfrentar problemas para otimizar as sua condições de PCR. Algumas simples ações podem resultar em um produto de PCR específico. Estas são as questões mais comuns aqui no laboratório:

1. Estou tendo (muitos) fragmentos inespecíficos maiores do que o esperado. O que fazer?

– Diminuir o tempo de anelamento da reação;

– Aumentar a temperatura de anelamento (aumento 2 graus a cada teste);

– Diminuir o tempo de extensão;

– Colocar menos primers;

– Checar e colocar menos DNA;

2. Estou obtendo fragmentos inespecíficos menores do que o esperado. O que fazer?

– Aumentar a temperatura de anelamento;

– Aumentar o tempo de anelamento;

– Aumentar a temperatura de extensão;

– Aumentar a temperatura de extensão para 74-78 oC;

– Colocar menos primers e/ou menos DNA.

3. A reação estava funcionando antes, mas agora eu não obtenho nenhum produto.

– Tenha certeza que todos os componentes estão na reação (tampão, DNA, primers…);

– Teste um novo Master Mix ou uma nova solução de dNTP (são sensíveis a descongelamentos consecutivos);

– Utilize um estoque novo de primers;

– Diminua sua temperatura de anelamento 6-10 oC, se não obtiver nenhum fragmento verifique todas os componentes.

Nos próximos posts vou comentar sobre técnicas de PCR: como RT-PCR, deleção de genes…

Dispositivos sintéticos: osciladores

ResearchBlogging.org
Um oscilador eletrônico é um circuito elétrico que produz um sinal eletrônico repetitivo, frequentemente uma onda senoidal ou uma onda quadrada. Eles são amplamente utilizados em aparelhos eletrônicos, incluindo aparelhos de transmissão de rádio e televisão.

Stricker e colaboradores (2008) descrevem a construção de um oscilador sintético biológico. Para isso, uma construção muito interessante foi utilizada, baseada em um promotor híbrido Plac/ara.  Este promotor possui dois operadores que respondem a dois sinais: ele é ativado por AraC na presença de arabinose e é reprimido por LacI na ausência de IPTG. Seguido a este promotor foi clonado os genes araC, lacI e o gene codificador da proteína luminescente GFP. Um pulso de IPTG foi utilizado para sincronizar as células, dessa maneira, AraC é traduzido resultando na ativação do sinal luminescente de GFP. Por outro lado, AraC ativa também a expressão de lacI resultando na repressão de araC e gfp, cessando o sinal luminescente. Como Lac I causa a repressão do próprio lacI, este acaba se reprimindo e um novo ciclo se reinicia (ver figura abaixo).

O período de oscilação pode ser ajustado modificando a concentração do indutor, por ex, podendo variar o período de 13 a 58 minutos. Na Figura acima o gráfico apresenta um período de 40 minutos. O mais interessante, para mim, é que o tempo de geração das bactérias do experimento varia  de cerca 22 a 27 min, assim, a informação e o sincronismo contido no oscilador passa de geração em geração.

Foi verificado que a indução da oscilação foi muito rápida (cerca de 5 min) e inicialmente bem sincronizada, analisando cada célula individualmente. A amplitude da oscilação foi caindo com o progresso do experimento, devido a dessincronização gradual de cada célula da colônia, como já era de ser esperar. Desse fenômeno, emerge um próximo tópico da biologia sintética, a comunicação célula-célula através do desenvolvimento de mecanismos de quorum sensing sintéticos. Assim, a próprias células podem se comunicar para coordenar e sincronizar o seu comportamento. Mas isso é assunto para posts futuros.

Stricker J, Cookson S, Bennett MR, Mather WH, Tsimring LS, & Hasty J (2008). A fast, robust and tunable synthetic gene oscillator. Nature, 456 (7221), 516-9 PMID: 18971928

Como desenhar um primer? E como montar uma reação de PCR?

No post passado eu comentei sobre a técnica de PCR e de como programar um PCR. Neste post eu vou um pouco mais adiante e vou falar sobre como desenhar um iniciador (primer) e como montar uma reação de PCR.

O desenho do primer tem que ser feito com muito cuidado para garantir o futuro do projeto, erros no desenho podem ser percebidos apenas muito tempo depois, após muito esforço e dinheiro já ter sido gasto no projeto. Por isso, realize essa tarefa com muito cuidado, tendo em vista todo o projeto.

A primeira coisa é pegar a sequência de interesse no GenBank, como por exemplo para o gene codificador da enzima xilose isomerase de Escherichia coli. Conheça o gene, busque artigos sobre ele, veja os genes que estão envolta, como ele é regulado,… Depois salve a sequência do gene e mais ou menos 200 bp envolta dele em um documento word. Encontre o start códon, o stop códon, promotor,… e decida a sua estratégia de clonagem.

Para desenhar primers para amplificar o gene inteiro você precisará de regiões envolta do gene. Além disso existem uma série de regras a que você precisa ficar atento para desenhar o primer como: composição de G-C, tamanho do primer, temperatura de anelamento, formação de dímeros e estruturas secundárias e muito mais. Para este trabalho, eu recomendo utilizar um software, o FastPCR. Um software livre (gratuito) e amigável.

É preciso apenas colocar a sua sequência de interesse e pedir para que ele desenhe os primers, depois você precisa checar se aquela sequência amplifica a sua região de interesse. Para a encontrar o primer reverso na sua sequência tem uma ferramenta para obter o reverso complementar da sequência, já que as sequencias de primers são dadas no sentido 5´ – 3´.

Finalmente, você pode fazer um PCR in silico, para isso, volte para o Genbank e copie toda a sequência do genoma da bactéria desejada (isso pode demorar alguns minutos) e passe para o FastPCR para fazer o PCR in silico com os primers desenhados. Com isso, você pode verificar possíveis regiões amplificadas pelo seu par de primers.

Depois de mandar sintetizar os primers, você pode fazer um programa como mostrado no post anterior. Para a reação PCR você deve seguir o protocolo da sua Taq polimerase comprada. Vale a pena ressaltar que para amplificações de genes que serão expressos posteriormente, recomendo uma Taq polimerase de alta fidelidade.

No próximo post vou comentar sobre erros e soluções comuns que ocorrem com reações de PCR.

O que é um PCR? Como montar um programa de PCR?

Polymerase chain reaction ou reação da polimerase em cadeia (PCR) é técnica de biologia molecular utilizada para amplificar (aumentar o número) de um ou de alguns pedaços de DNA em várias ordens de magnitude, gerando milhões de cópias de uma sequência particular de DNA.

Utilizando um termociclador (aparelho que permite mudanças rápidas de temperatura), uma DNA polimerase, um par de iniciadores (primers) e dNTP´s (deoxinucleotídeos, que formarão a nova molécula de DNA) é possível sintetizar in vitro DNA a partir de uma fita molde.  Veja o vídeo no youtube.

Diz a lenda que Kary Mullis teve a idéia do PCR em um daqueles momentos de ócio produtivo enquanto surfava nas ondas do Sul da Califórnia. Um ano mais tarde, 1983, a sua idéia virou realidade através do desenvolvimento da primeira máquina de PCR. Dez anos mais tarde, 1993, Mullis também foi surfar após receber a notícia que havia sido ganhador do prêmio Nobel pela sua invenção. Essa é uma ótima desculpa para não trabalhar aos finais de semana no laboratório! (rs)

A partir do programa de PCR básico abaixo é possível desenhar um programa específico para seu iniciador e fragmento a ser amplificado. No passo (step) 2, ocorre a denaturação do DNA, No passo 3, ocorre a ligação do iniciador ao seu DNA, para isso é preciso calcular a temperatura de anelamento do seu iniciador. Existe um cálculo baseado na composição dos iniciadores (Ta = 2(A + T) + 4(C + G) – 5), mas existem alguns softwares que calculam para você (porém esta temperatura não deve ser abaixo de 50oC, para evitar ligações inespecíficas). Após a ligação dos iniciadores ao DNA, irá ocorrer a síntese de DNA pela DNA Polimerase, normalmente se utiliza a Taq polimerase que possui uma temperatura ideal de 72oC. O tempo de elongamento da sua sequência depende do tamanho dela, calcula-se cerca de 1 min para cada 1000 pares de base (não menos de 30 segundos). Finalmente, este ciclo será repetido 30 vezes.

Programa básico de PCR:

Step         Temperature (°C)      Time (min)

1                     95                                    2:00

2                     95                                    0:30

3                     55                                    0:30

4                    72                                      1:00

5                    Go to step 3,                    30 times

6                     4                                        forever

No próximo post vou comentar sobre o desenho de iniciadores (primers) e como montar uma reação de PCR!

Reunião no dia 10/03, dispositivos sintéticos: osciladores e dinâmica

Olá pessoal, está confirmada para o dia 10/03, logo após o carnaval, a nossa terceira reunião do Synbio Science Club. As reuniões voltarão a ser na sala 101 aqui no ICBII na USP.

  • 10/03/2011, 3 pm, Oscillators & Dynamics

A Synthetic Oscillatory Network of Transcriptional Regulators. Elowitz MB, Leibler S. Nature. 403:335-8. (2000).

A fast, robust and tunable synthetic gene oscillator. Stricker J, Cookson S, Bennett MR, Mather WH, Tsimring LS, Hasty J. Nature. 456:516-19 (2008).

Nos vemos lá!

Clube de Biologia Sintética da Universidade de São Paulo!

Agora é oficial! Foi aprovado pelo conselho do Departamento de Microbiologia da Universidade de São Paulo o nosso Clube Científico de Biologia Sintética. A partir de agora, poderemos divulgar, reservar uma sala para as reuniões e receber nossos colegas da Poli e outros Institutos para discutirmos synbio!

SynbioBrasil Science Club: Participe!

Dispositivos sintéticos: uma bactéria que conta!

ResearchBlogging.org

Para quem não leu, antes de ler este post, vale a pena ler o post anterior do interruptor para entender alguns conceitos básicos. Um contador é um componente central para circuitos digitais e de computação que guarda (e às vezes mostra) o número de eventos ou processos que ocorreram.

Neste trabalho é descrita a construção de contadores sintéticos para bactérias. Após a construção de um dispositivo aparentemente simples, Friedland et al. (2009) sofisticam bastante a construção do regulador para garantir uma resposta (contagem) robusta.

O primeiro contador descrito pelo trabalho é o “contador riborregulado por uma cascada transcricional” (riboregulated transcriptional cascade counter). Ele conta pulsos de arabinose no meio de cultura utilizando como sinal uma proteína luminescente (GFP). São riborregulados porque o taRNA (controlado por um promotor sensível a arabinose) se liga a cr e impede a formação de um grampo (pareamento) entre RBS e cr. Dessa maneira,  permite o reconhecimento do RBS (sítio de ligação do ribossomo) pelo ribossomo e a tradução do gene (ver Figura abaixo). O interessante é que a transcrição do taRNA é regulada por um promotor sensível a arabinose. Assim, no primeiro pulso de arabinose, ocorre a transcrição de taRNA que permite a tradução da RNA polimerase T7. Após o primeiro pulso a arabinose e taRNA são degradados. No segundo pulso ocorre, da mesma maneira, a transcrição da RNA polimerase T3 através do promotor PT7 que é especificamente reconhecido pela RNA polimerase T7. No terceiro pulso, ocorre também através da mediação de taRNA e da polimerase T3, a transcrição de GFP. Dessa maneira, a bactéria responde aos 3 pulsos de arabinose com um sinal luminescente.

Porém foi verificado um vazamento de expressão de GFP nos pulsos intermediários, além disso, demonstrou-se que se o pulso de arabinose não é dado a uma intensidade e frequência corretas, o contador  não funciona direito. Isto provavelmente ocorre devido aos limites cinéticos intrínsecos envolvendo os tempos de transcrição e degradação de mRNA.

Por esse motivo, um segundo (e muito mais bacana) contador foi construído, chamado contador de cascada de DNA invertase (DNA invertase cascade counter). Que basicamente acoplou ao modelo anterior um controle de invertases na região promotora.

Uma invertase é uma enzima muito interessante, as enzimas Cre, por ex., reconhecem determinadas sequências de DNA que flanqueiam uma determinada região de DNA e invertem a orientação dessa região. Essa enzima é utilizada para ativar os promotores através da inversão de sua orientação (ver Figura abaixo). Com essa construção foi possível obter um controle muito maior da expressão de GFP, ocorrendo, após o terceiro pulso, uma expressão muito maior de GFP. Este contador agora é muito mais robusto em relação à variação de tempo entre os pulsos de arabinose, podendo contar pulsos realizados em intervalos de tempo de 2 a 12 horas. Este novo dispositivo, além de mostrar o sinal luminescente, grava a informação no DNA através das recombinações.

Os autores foram ainda mais longe, trocaram o promotor de sensibilidade a arabinose por promotores capazes de responder a diferentes sinais. Dessa maneira, o dispositivo pode ser programado para gravar e responder diferentes sinais na ordem desejada. Incrível!

Esse dispositivo genético pode ser programado para diferentes funções a fim de sincronizar diferentes sinais para uma determinada resposta. Dependendo dos sinais acoplados ao dispositivo, estes mecanimos podem ser utilizados para biosensores, biorremediação ou na medicina.

Friedland, A., Lu, T., Wang, X., Shi, D., Church, G., & Collins, J. (2009). Synthetic Gene Networks That Count Science, 324 (5931), 1199-1202 DOI: 10.1126/science.1172005

Congresso do Bioen sobre Bioenergia BBEST

Em agosto irá acontecer o 1st Brazilian BioEnergy Science and Technology  Conference que irá discutir diversos aspectos do desenvolvimento de biorrefinarias, como produção de enzimas, análise de ciclo de vida, engenharia metabólica e biologia sintética. Eu vou!

Dispositivos sintéticos: interruptores de expressão gênica

Só agora tive tempo para fazer um post sobre a nossa segunda reunião do Clube Científico de Biologia Sintética da USP que, com certeza, vai render alguns posts.  Conversamos sobre uma das primeiras construções genéticas de biologia sintética visando a robustez no controle de expressão: a construção de um interruptor genético (toggle switch, flip flop,..). Robusto porque é capaz de funcionar corretamente a partir do modelo apesar de várias incertezas do sistema.

Mas para entender o dispositivo, vou comentar alguns conceitos básicos de biologia molecular: (i) promotores são regiões do DNA que antecedem os genes e são reconhecidas pela RNA polimerase e um fator sigma associado para facilitar a transcrição do gene, (ii) transcrição é processo de criação de um RNA complementar a sequência de DNA que posteriormente pode ser traduzido por um ribossomo a uma proteína, finalmente, (iii) um repressor é uma proteína de ligação de DNA que regula a expressão de genes, através da ligação a um operador, e bloqueia a ligação da RNA polimerase no promotor, impedindo a transcrição de genes.

Utilizando esses conceitos básicos de biologia molecular, Gardner e colaboradores (2000) construíram um interruptor para regular a transcrição de genes em E. coli. Chama-se um interruptor porque possuiu dois pontos de equilíbrio (acesso ou apagado, direita ou esquerda, expressão de X ou expressão de Y). Vou dar o exemplo de apenas uma das construções, em que o repressor 2 (repressor LacI) reprime o promotor 2 (Ptrc-2), e o repressor (repressor Tet) reprime o promotor 1 (PltetO-1).  A substância IPTG (Indutor 2) inibe o repressor 2 e aTC (Indutor 1) inibe o repressor 1 (ver Figura abaixo).

Dessa maneira, basicamente, temos dois pontos de equilíbrio: (i) com a presença de aTC, o repressor 2 é transcrito e ocorre a repressão do promotor 2, não havendo assim a transcrição do gene repórter (no caso uma proteína luminescente GFP); (ii) e na presença de IPTG em que ocorre a transcrição do promotor 2, e conseqüente transcrição de GFP e do repressor 1.

Dessa maneira, existem dois estágios: aceso (transcrição de GFP) e apagado (sem transcrição de GFP). Este sistema é robusto porque funciona de acordo com o modelo proposto:

Onde u é a concentração do repressor 1, v é a concentração do repressor 2, α1 é a taxa efetiva de transcrição do repressor 1, α2 é a taxa efetiva de transcrição do repressor 2, β é taxa de cooperatividade da repressão do promotor 2 e γ é taxa cooperatividade de repressão do promotor 1. A ação deste modelo corresponde a seguinte estrutura gráfica:

Este gráfico representa os dois pontos de equilíbrio do sistema, o estado 1 e o estado 2 (aceso e apagado, na presença de um dos indutores) e um outro ponto instável de equílibrio que mostra os dois repressores se regulando mutuamente. Seria mais fácil de entender se houvesse, de uma lado uma proteína luminescente verde e  do outro lado do dispositivo uma proteína luminescente amarela. Os estados de equilibro 1 e 2 representam verde ou amarelo, enquanto o ponto instável de equilíbrio representa a ausência de cor.

Este tipo de dispositivo pode ser utilizado na biotecnologia para regular vias metabólicas inteiras, ligando e desligando vias de acordo com um sinal externo; ou na medicina para acionar a resposta a um remédio por exemplo. Funcionam de uma maneira mais eficiente do que o controle via promotores específicos. No próximo post, vou comentar a utilização desse dispositivo para desenvolver uma bactéria que conta!

Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Gardner TS, Cantor CR and Collins JJ. Nature 403: 339-342 (2000).

Revistas científicas de Biologia Sintética

Há alguns posts atrás eu reuni alguns laboratórios de biologia sintética espalhados pelo mundo. É muito bacana para saber quem é quem nesse mundo científico. Porém, para saber o que estas pessoas e outras pessoas andam pensando é preciso ler o que eles publicam. Por isso, desta vez eu reuni as principais revistas de Biologia Sintética.

Fica aí a dica: dar uma olhada nessas revistas todo mês para ver o que está acontecendo no mundo synbio!

Nature – Molecular Systems Biology

BMC Systems Biology

Springer – Systems and Synthetic Biology

Journal of Biological Engineering

PLoS – Computational Biology

Journal of the Royal Society – Focus on Systems Biology

 

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