FAQ #4 Onde colocar esses pedaços de DNA?

FAQ da Bioengenharia 4

“No genoma, né, dêr!”. Certo, mas como? E será que o genoma é o único lugar que podemos colocar esse novo pedacinho de DNA no micro-organismo que queremos modificar? Não! Existe outro lugar também e ele se chama plasmídeo (quem já jogou BioShock vai soltar umas sinapses a mais agora).

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O plasmídeo é um DNA circular presente em várias espécies de seres vivos e é responsável por conter informações valiosas envolvendo a sobrevivência do organismo a fatores externos (como por exemplo sua resistência a um antibiótico), além de ser o principal ator da transferência horizontal de informação genética, ou seja, a passagem de um DNA funcional de um ser vivo para outro sem haver hereditariedade (é aí que o jogo BioShock extrapola isso para seres humanos). Adivinha de onde veio a ideia de usar o plasmídeo como transmissor – “vetor” – de informação genética para modificar as células? Veio exatamente desse mecanismo natural de realizar transferência horizontal de genes que vários micro-organismos possuem, então aproveitamos para fazer a transferência das informações genéticas que nós queremos!

E se vamos usar plasmídeos é preciso extraí-los também! Os plasmídeos são moléculas de DNA assim como os pedacinhos obtidos a partir de um genoma, e multiplicados pela PCR, que vamos introduzir no microorganismo, mas aqui há uma etapa importante durante a extração de DNA onde é feita a separação do conteúdo plasmidial do genômico.

O vídeozinho abaixo tem uma animação no ínicio e depois mostra o procedimento do isolamento do plasmídeo em lab!

Por Otto Heringer e Viviane Siratuti.

Aventuras em Biologia Sintética

Drew Endy

Eu considero os quadrinhos como uma das formas mais interessantes de se narrar uma história. São também uma ótima forma de divulgar ciência de uma maneira didática e divertida.

Drew Endy um dos pais da biologia sintética (e do Registry of Parts), juntamente com Isadora Deese (ambos do MIT) elaboraram o quadrinho Adventures in Synthetic Biology. E tem mais: o quadrinho foi publicado no website da prestigiada revista Nature.

Confira Adventures in Synthetic Biology e aprenda de maneira didática o que são biobrickPoPs, entre outros conceitos básicos.

 

Links possivelmente interessantes:

 

Microalgas na Biologia Sintética

ResearchBlogging.orgNa penúltima reunião do Clube de Biologia Sintética foi discutido em que pé andam as pesquisas envolvendo microalgas – uma das milagrosas fontes energia sustentável e fixação de CO2 – no contexto da Biologia Sintética. O apresentador da vez, João Molino, com base nos conhecimentos que vem adquirindo no seu doutorado na Farmácia (FCF) aqui na USP, nos deu um review dos trabalhos com microalgas usadas em Biologia Sintética, além de falar um pouco de como as microalgas são incríveis para converter energia solar em bioprodutos e – consequentemente – fixar CO2. Com isso ele sugere no final algumas oportunidades que poderíamos usar para projetos do iGEM do ano que vem.

Vídeo com “Pipotecnica”

Como tivemos problemas envolvendo a transmissão da reunião (que já era feita de maneira precária), resolvemos gravar novamente a apresentação, só que desta vez utilizando uma nova pirotecnia dos vídeos da internet, o Popcornmaker (veja mais sobre ele nessa palestra de 4min no TED). Junto ao vídeo irão aparecer muitos links e informações extras diretamente da wikipédia em inglês (nunca substimem a wikipédia em inglês!), portanto se quiser saber mais sobre alguma informação “ao vivo” durante o vídeo, cheque os links! [clique na imagem abaixo para ir ao vídeo em outra aba]

Anotações Pessoais

Apesar do custo/benefício das pesquisas de microalgas na indústria não ser muito bom – segundo o que o Mateus me contou outro dia – suas características são muito provocativas para serem usadas como solução ecológica para muitos problemas e melhorar bastante processos de produção de bioprodutos já existentes. Ela faz coisas simplesmente incríveis. Como o João mostra no vídeo, ela é campeã na produção de galões/acre de óleo, além de poder viver em ambientes completamente isolados, como em uma garrafa fechada por exemplo – diga aí, qual ser vivo que você encontra no seu dia a dia (sem contar microalgas né…) que consegue viver muito bem e por muito tempo num ambiente completamente fechado e sem ar! Ela também fixa CO2 que é uma beleza, produz hidrogênio (hidrogênio cara!) e ainda pode ser usada como biorremediador (e de fato é naturalmente) para limpar áreas contaminadas!

Além de ser muito interessante biotecnologicamente, as microalgas são um grande gargalo na biologia sintética devido à falta de BioBricks e de elementos de DNA padronizados, como suas sequências terminadoras. O que é bem legal para o Registry of Parts e para o iGEM: partes inéditas! O time do chile do iGEM deste ano foi um dos primeiros a conseguir transformar cianobactérias (“parentes” das microalgas) com sucesso utilizando BioBricks na competição, o que é um bom indício para se trabalhar com microalgas.

O Grande Desafio

Apesar disso tudo, trabalhar com microalgas é algo bem desafiador, muito por causa do item mais valioso que se tem em laboratório: tempo. Um processo inserção de vetor nas células que duraria apenas (no máximo!) 2 dias de trabalhando com E.coli, com nossas amigas verdinhas duraria cerca de uma a duas semanas (se não me engano, segundo o que o João me contou). Para se fazer um projeto desse tipo estaríamos um pouco limitados para o pouco tempo do iGEM, a não ser que nos organizássemos muito bem (ainda estamos trabalhando nesse quesito). Mas o interessante é que aparentemente elas são bem geneticamente estáveis quando se tratando do vetor inserido; pelo o que o João nos contou, algumas microalgas transformadas duram anos com o seu novo pedaço de DNA. O processo de transformação também é aparentemente tranquilo e sem muito mistério.

Seguindo com os nossos objetivos de criar um projeto para o iGEM, muitas ideias surgiram da potencialidade de trabalhar com microalgas. Particularmente, comecei a pensar num sistema em que as microalgas “alimentassem” uns extremófilos, para que eles produzissem um efeito desejado com suas habilidades únicas da natureza – habilidades extremas! Mas discorro sobre isso em futuros posts.

Referência Principal

Durante o vídeo, muitas referências interessantes apareceram com ajuda  do Popcornmaker, mas a referência principal que guiou o overview que o João nos fez é essa aí embaixo:

  • Wang B, Wang J, Zhang W, & Meldrum DR (2012). Application of synthetic biology in cyanobacteria and algae. Frontiers in microbiology, 3 PMID: 23049529

Polimerase Por Segundo

ResearchBlogging.orgA Biologia é imprecisa por natureza, e vice versa. Isso é uma grande dificuldade ao se fazer design de sistemas biológicos sintéticos; aquilo que é muito bonito no papel às vezes nunca pode ser feito por motivos obscuros e por excesso de ruído dos sinais do sistema. Não dá pra prever. Na tentativa de deixar dispositivos sintéticos mais previsíveis, a Biologia Sintética tenta padronizar não somente partes biológicas, mas também os sinais que a compõem a dinâmica de seu sistema. Esses sinais são justamente a passagem de informação entre DNA e o fenótipo desejado, mas… como diabos deixar isso mais preciso e medir a velocidade dessa passagem de informação? Como medir “Polimerases Por Segundo”?

Padronização da Transmissão de Informação

Independente do que um aparelho elétrico faça, existem sinais “universais” que pertencem a todos eles: variações na diferença de potencial, na corrente, no campo elétrico e etc. A transmissão de informação entre os dispositivos eletrônicos que compõem esse aparelho são dadas justamente através desses sinais, fazendo todo o sistema elétrico funcionar. Em circuitos genéticos, sinais análogos à corrente elétrica são as taxas de transcrição e tradução, ou mais especificamente, a velocidade com que – respectivamente – uma polimerase e um ribossomo “leêm” seus nucleotídeos. O problema é que esses sinais (as taxas de transcrição e tradução) não são bons como transmissores de sinais. Entenda o porquê:

PoPS e RiPS: Qual é o sentido disso!?

Para que um transmissor de sinal seja bom, ele precisa facilitar com que dispositivos possam ser facilmente combinados em um sistema – além de ser algo “universal”, como foi dito anteriormente. Foi aí então que, usando experiências da engenharia, os biólogos sintéticos cunharam o termo “PoPS” (Polimerase Per Second – Polimerase Por Segundo) e “RiPS” (Ribossome Per Second – Ribossomo Por Segundo). Muitos pesquisadores acham que a criação desses novos termos é como “reinventar a roda”: qual seria a grande diferença entre isso e as clássicas taxas de transcrição e tradução? A diferença é a abrangência da nova medida. Quando se trata de um sítio operador, um RBS, um RNAm e o próprio gene sendo “lido”, não há diferença alguma em se medir uma taxa de transcrição e o “PoPS” ou uma taxa de tradução e o “RiPS”. Mas faz sentido se medir a taxa de transcrição de um sítio terminador por exemplo!? Esse elemento de DNA, que teoricamente não é transcrito (é ele quem justamente para a transcrição), ainda pode eventualmente ter um “leak” e permitir a passagem de uma polimerase. Usar a expressão “… a taxa de transcrição de um sítio terminador …” não faz sentido nenhum, mas acontece. Se usarmos PoPS, que por definição é o número de vezes que uma RNA polimerase passa por um ponto específico de uma molécula de DNA por unidade de tempo, ainda há sentido, pois nessa definição não importa qual a região do DNA a Polimerase passa. É esse tipo de generalidade que permite o fácil uso e novas combinações de dispositivos sintéticos.

Hierarquia de Abstração

Com a criação de sistemas fáceis de se integrar, os engenheiros biológicos podem se beneficiar de métodos largamente praticados em qualquer campo da engenharia, como a hierarquia de abstração. Com isso é mais simples se lidar com a complexidade de sistemas biológicos quando se omite informações desnecessárias. Desse modo (ver imagem abaixo), alguém trabalhando no nível de abstração das partes biológicas não precisa se preocupar com o design e síntese do DNA que usará, do mesmo modo, alguém trabalhando no nível sistêmico precisa pensar em apenas quais dispositivos incluir e como conectá-los para realizar uma função desejada, sem precisar se preocupar com os outros níveis de abstração.

Imagem retirada de: D. Baker, G. Church, J. Collins, D. Endy, J. Jacobson, J. Keasling, P. Modrich, C. Smolke, and R. Weiss. ENGINEERING LIFE: Building a FAB for biology. Scientific American, pages 44–51, June 2006.

Como medir PoPS?

A maioria dos sistemas criados e estudados hoje em dia em Biologia Sintética envolve controle transcricional da atividade genética, o que faz do PoPS a variável mais difundida na área, principalmente pelas pesquisas envolvendo lógica booleana em sistemas genéticos (portanto não é muito comum encontrar “RiPS” em artigos por aí).
Não existe um método direto para se medir PoPS, mas é possível chegar em seu valor indiretamente através de medições de fluorescência de genes reporter. É possível – se você puder encontrar os parâmetros na literatura ou medí-los – encontrar o PoPS de um dispositivo em cinco passos:

Cinco Passos Para o PoPS

1. Ligação de um Gene Repórter como Output

Antes de mais nada, será preciso de um fluorímetro (é claro) e demum espectofotômetro para medir densidade celular. Como exemplo, vamos observar a parte BBa_F2620:

Esse BioBrick tem como “entrada” a substância de quorum sensing 3-oxohexanoil-homoserina lactona e tem como “saída” PoPS. Em presença de 3OC6HSL, o gene que produz o fator de transcrição luxR promove a transcrição de genes após o Lux pR, na parte final do BioBrick BBa_F2620. Para mensurar o quão ativo o luxpR fica, liga-se outro BioBrick no final do dispositivo para mudar o output do sistema colocando-se o BBa_E0240 – a ORF (Open Reading Frame) do GFP (Green Fluorescent Protein):

Assim tem-se uma nova parte, o BioBrick BBa_T9002:

2. Medição da Fluorescência e Absorbância e Subtração do Background

Para medir a fluorescência do GFP e a absorbância da amostra de células, é preciso criar dois controles: um da absorbância (A) e outro da fluorescência (G). O controle da fluorescência será o próprio BBa_T9002 sem ser induzido pela substância de quorum sensing (G_não-induzido), enquanto o controle da absorbância é feita da maneira trivial, verificando somente a absorbância do meio de cultura (A_background). Para se obter os reais valores de Fluorescência induzida por 3OC6HSL e da densidade celular, basta então subtrair esses valores de background com os valores medidos durante a indução pela substância de quorum sensing:

3. Correlação com a Curva Padrão

Com as correções em mãos, outro procedimento trivial a ser feito é encontrar a curva padrão de fluorescência versus GFP e de absorbância versus número de células. Por exemplo, experimentos feitos em laboratório chegaram a essas retas de correlação de valores:

Em que UFC é “Unidade Formadora de Colônia” – o número de células na amostra. E “GFP” seria o número de moléculas de GFP medidas.

4. Interpolar a Curva de GFP versus Tempo Obtida na Medição

A síntese total de GFP por célula (S_célula) é dada pela taxa de produção de GFP total (S_total) dividida pelo número de células (UFC):

Para encontrar a derivada de [GFP] por tempo, basta plotar os dados de GFP obtidos por tempo e interpolar com uma função logística (provavelmente) para obter a equação que melhor descreve a variação de GFP no tempo.

5. Colocar os Valores Nessa Equação Aqui

Depois de determinada a função Scélula, basta colocá-la nessa fórmula e encontrar o PoPS:

Em que:
a = Taxa de maturação do GFP – 1/s
GammaM = Constante de degradação do RNA – 1/s
GammaI = Constante de degradação do GFP imaturo – 1/s
Rô = Constante de síntese proteica por RNAm (RiPS) – [Proteína]/[RNAm].s
PoPS = Polimerase por segundo – [mRNA]/[DNA].s

CUIDADO: Conteúdo Matemático – Prossiga com Cuidado (Ou não…)

Chega-se nessa expressão através de um pequeno sistema de equações diferenciais:

As equações expressam uma dinâmica simplificada de um sistema de transcrição e tradução de uma informação genética. Para chegar na expressão de PoPS, basta substituir a última equação na segunda e isolar M. Com a expressão resultante, basta substituir a variável M na primeira equação e sua derivada em dM/dt.

ATENÇÃO: Aqui acaba o conteúdo matemático. Está tudo bem agora.

E essa é a história de como você pode encontrar o PoPS – essa variável estranha! – no seu próprio laboratório (ou ao menos entender do que se trata). Assim como um circuito elétrico, que pode ser montado da melhor maneira possível e mesmo assim não funcionar por razões obscuras, sistemas biológicos têm muito mais esse problemático costume de não se comportar como esperado. Contudo essa abordagem mais generalista da atividade transcricional de uma célula é uma boa maneira de se tentar enfrentar o grande desafio de se deixar a biologia mais “engenheirável” e mais “precisa”. Não que essa seja a coisa mais fácil do mundo, mas ela nunca será se ninguém tentar. E estamos aos poucos conseguindo.

Referências:

Synbio na terra da Mafalda

Autor: Ivan Lavander, estudante de Ciências Biológicas – USP

Entre os dias 16 e 22 de abril rolou um curso introdutório de biologia sintética, o primeiro desse tipo na America Latina, hosteado pela Universidade de Buenos Aires e financiado pela Organização Europeia de Biologia Molecular (EMBO). Eu fui um dos participantes selecionados, e vou divulgar numa série de posts um pouco do que rolou por lá =)
Esse é um primeiro post sumarizando o curso, e os próximos posts com a sigla [SBAr] se referem ao conteúdo do curso!

Estrutura do Curso – O curso se focou em introduzir os participantes nos principais métodos, estratégias e desafios do synbio. Mesmo nessa fase inicial, algumas idéias e principios já se definem como parte essencial da biologia sintética, incluindo quatro principais tópicos: estratégias bottom-up, top-down, algumas filosofias malucas sobre biobricks e aplicações. Durante o curso, esses tópicos e seus respectivos objetivos foram distribuídos abordados da seguinte forma:

(1)   Da complexidade natural à artificial;

Antes de desenvolver novos circuitos, é preciso se entender a organizaçào e “robustez” dos circuitos naturais. Integrar os dados de bancos de dados, assim como o montante de dados gerados por tecnologias de “high throughput”, que geram quantidades absurdas de dados, possibilitam observar com grande profundidade a dinânica do genoma, transcriptoma, proteoma, metaboloma e suas interações. Como selecionar e aplicar essa montanha de informação originária da natureza e quais métodos devem ser utilizados para otimizar essas redes de informação em circuitos sintéticos?

(2)   Estratégias bottom-up;

Bottom-up, ou “de baixo pra cima”, é a estratégia usado pra construir coisas com legos: usar partes intercambiaveis e bem conhecidas que podem ser utilizadas para se desenvolver sistemas de diferentes complexidades (em contraposição a estratégias top-down, onde mal se conhece o funcionamento do sistema, quanto mais sua complexidade, mas é preciso regula-lo para combater doenças, por exemplo). Esse jeito bottom-up de fazer synbio é uma das areas mais revolucionárias em synbio, trazendo uma nova visão open source de como produzir ciência. Assim, tem-se elevado, através da constante caracterização de novas partes biológicas, a complexidade e potencial de desenvolvimento de novos circuitos biológicos sintéticos pela utilização desses legos biológicos.

(3)   “Life is computation!”;

Modelos físicos teóricos predizem e eu não entendo porra nenhuma com bastante precisão sistemas complexos, e tem ajudado a revelar mecanismos antes inimagináveis de controle de expressão gênica. Esses modelos ajudam a guiar o design de circuitos sintéticos e a otimiza-los.

(4)   Interfaces entre circuitos sintéticos e naturais;

Diferente da estratégia bottom-up, alguns circuitos de interesse são extremamente complexos, dependem de fatores externos ou suas “partes” são pouco conhecidas – pelo menos com quanto as diferentes interações possíveis. Uma estratégia top-down, “de cima pra baixo”, permite regular sistemas biológicas sem que cada parte envolvida tenha sido “reconstruída” ou, no mínimo, seja totalmente conhecida como no caso de biobricks. Seria como desativar, ativar ou modular alguma parte pra ver se continua funcionando ou o que deixa de funcionar. E essa é uma das grandes promessas e revoluções do synbio: usar circuitos sintéticos em interface com circuitos complexos naturais para controlá-los ou modulá-los.

Os participantes 

A organização do curso foi feita pelos professores da Universidade de Buenos Aires Dr. Alejandro Nadra, o Dr. Ignacio Sanchez (o nacho!) e o Dr. Raik Grünberg, da Alemanha, todos advisors do primeiro time argentino do iGEM <http://igem.qb.fcen.uba.ar/site/#page_2/> e que vao ganhar um espaço próprio num futuro post.

Os palestrantes, Dr. Marc Güell, pos doc no Church lab em Harvard, e a Dra. Reshma Shetty, co-fundadora da Ginkgo Bioworks http://ginkgobioworks.com/, uma start up de synbio norte americana, falaram sobre a integração de bancos de dado e otimização de redes naturais para se criar circuitos artificiais. O Dr. Drew Endy (primeiro comentário: imagina um cara com cara de gringo, segundo: dizem por aí que ele é “o próximo steve jobs”) co-fundador da BioBricks Foundation e um dos idealizadores do iGEM, falou sobre estratégias bottom-up e biobricks ohreally?. O Dr. Roman Jerala (o principal advisor do time da Slovenia que ganhou duas vezes o grand award do iGEM) e a Dra Chirstina Smolke (uma das principais pesquisadoras de switches de RNA e professora de bioengenharia em Stanford) falaram sobre modulação de circuitos naturais usando estratégias de top-down (DNA origami, riboswitches, proteínas fusionadas) e o Dr. Thierry Mora e a Dra. Aleksandra Walczak mostrou o que a França tem de melhor, ambos da Ecole Normale Supérieure e do CNRS, falaram sobre modelagem teórica de redes complexas e aspectos teóricos do design de circuitos gênicos.

Mais informações:

http://events.embo.org/12-synthetic-biology/

A Incrível Sociedade dos Microrganismos


ResearchBlogging.orgÉ bem óbvio que um ser humano não existiria sozinho. Não só porque ele não poderia ser gerado, mas porque dificilmente conseguiria sobreviver. Já reparou na quantidade de pessoas que permitem (e permitiram) que você tivesse o dia de hoje como você tem? Cada parafuso, tecido, metal, tijolo e etc que permite você estudar, trabalhar, andar de automóvel, comer e ler esse texto foram pensados, feitos, montados, transportados e vendidos por alguém. Não é possível portanto tentar entender os humanos, bem como a maneira com que eles se comunicam, isoladamente. É preciso olhá-los sistemicamente, como seres sociais. As bactérias também. É cada vez mais reconhecido que as bactérias não existem como células solitárias, mas são como um “organismo colonizador” que elabora complexos sistemas de comunicação que facilitam a sua adaptação às recorrentes mudanças ambientais. E elas nascem poliglotas. A seleção natural esculpiu em diferentes espécies diversos genes que as permitem se comunicar cooperativamente e repressivamente entre espécies e até mesmo entre reinos (como por exemplo em bactérias patogênicas). Damos à essa comunicação bacteriana o nome de “quorum sensing” (“detecção em quórum” – tradução livre).

Quorum Sensing

O termo “quorum sensing” foi cunhado devido à habilidade dos microorganismos expressarem ou aumentarem a expressão de certos genes quando em grande população, podendo dessa forma monitorar a densidade celular (quantidade de células ao seu redor) antes de manifestar algum fenótipo. Um dos exemplos mais ilustrativos disso é da Dictyostelium discoideum, um protozoário que passa uma das fases do seu ciclo de vida produzindo um corpo multicelular. Tem um vídeo bem legal mostrando a formação de um corpo de frutificação através de várias células individuais de Dictyostelium:


Reparem rapidamente em 00:30 min as células se locomovendo em “pulsos”, na direção de um local em que todas estão se agregando (é difícil de perceber!). Esse local inicial é em geral onde um grupo de bactérias encontrou alguma fonte de nutrientes. A “pulsação” da locomoção das bactérias acontece devido à substância de quorum sensing que é difundida pelo espaço vinda das células do local de agregação; um pulso inicial provoca – quando em uma população não muito grande, para ser perceptível – um comportamento oscilatório de resposta das células: quando uma célula recebe um sinal (do tipo “Ei, tem comida aqui!”), ela emite um de volta (como se etivesse gritando “Caramba, tem comida lá!”), que é recebido pelas células que mandaram o sinal incialmente (o que seria um “Ótimo! Estou indo praí!”) e por outras ao seu redor, propagando o sinal. Como a transmissão de informação com as substâncias não é imediata e nem totalmente contínua, observa-se os “pulsos”, que são resultado do “gap” entre enviar e receber informações pela difusão de moléculas.

As diferentes Línguas das bactérias

Tabela com exemplos das diferentes famílias de substâncias de QS, as diferentes "línguas" das bactérias. Imagem modificada de S. Atkinson e P. Williams (2009) e de Y. He e L. Zhang (2008). Referências no final do post.

As “línguas”, ou simplesmente certas coisas que as bactérias querem “dizer” (como “Estou afim de dar uma reproduzida!” ou “Fujam, eles estão vindo!”) são “ditas” através de diferentes tipos de substâncias que os microorganismos produzem. No caso da Dictyostelium ali em cima, a substância é AMP cíclico (é quase um ATP, só que duas vezes menos fosfatado… e cíclico, é claro), mas se tratando de bactérias – que ainda é a principal plataforma de aplicação da Biologia Sintética – existem três tipos principais de substâncias de quorum sensing: as acil-homoserinas lactonas (HSL ou AHL), auto-indutores 2 (AI-2) e pequenos ácidos graxos, chamados de “DSF”s (Diffusible Signal Factor – do inglês: Fator Sinalizador Difusível). Existem ainda outras famílias de substâncias de QS, mas aparentemente menos comuns que essas três principais.

O Mecanismo Gênico

A ativação dos sistemas de QS só ocorre em uma alta densidade celular. Isso permite que se chegue uma concentração limiar de substâncias de QS para expressão de genes. 1, 2 e 3 são os três elementos básicos de DNA para se construir um sistema de QS. Imagem modificada de NA. Whitehead et al (2001), referência no final do post.

Para um microrganismo ganhar a abilidade de “falar em outra língua”, em geral são necessários apenas três elementos de DNA: um gene que gere uma enzima que produza uma substância de QS, outro gene que produza o “receptor” dessa substância – que em geral é um fator de transcrição – e um promotor, no qual o fator de transcrição (após se associar à substância de QS) se liga para controlar a expressão gênica (imagem ao lado).

Se uma bactéria (por exemplo) “fala” a mesma “língua” que suas companheiras de colônia, como ela diferenciaria então um sinal próprio (a própria substância de QS sendo produzida) de um sinal de outras células (substância de QS externa)!? Isso é importante, porque se a bactéria receber o próprio sinal que envia, ela entrará em um processo autocatalítico que resultará em uma contínua auto-ativação da célula independente do sinal das bactérias ao seu redor. Acontece que uma bactéria não produz níveis suficientes de QS para “se ouvir”. Sem o sinal externo, a transcrição de genes pelo sistema de quorum sensing é fraca e insuficiente para iniciar um feedback positivo; apenas em alta densidade celular se consegue alcançar uma concentração crítica de substâncias de QS para estimular a transcrição dos genes que o QS controla.

Quorum Sensing no iGEM

Apesar de não ser um meio de transmissão de informação tão rápido e eficiente como o dos light switches, os sistemas de QS são bastante utilizados em dispositivos sintéticos devido à sua especificidade e falta de “falsos sinais” – afinal, é extremamente fácil estimular não-intencionalmente uma célula sensível à luz. No Registry of Parts existem cerca de 6 sistemas de QS completos, padronizados e disponíveis para construção, todos usando (em geral) diferentes AHLs, usados tanto na ativação e inibição da expressão de genes.

Exemplos de utilização desse sistema de transmissão de informação não faltam no iGEM. Já tratamos no blog de um dos inúmeros projetos do iGEM que utilizam quorum sensing, o da Unicamp de 2009. Em seu projeto, o time brasileiro utilizou sinais de AI-2 como um “sistema de alerta” em bactérias produtoras de bioprodutos em um bioreator. Quando um microrganismo contanimante surgisse (produzindo AI-2), o sistema de QS atuaria para comunicar sua presença a todas as bactérias ao redor do organismo invasor, iniciando gatilhos gênicos para produção de substâncias nocivas ao contaminante, afim de exterminá-lo do bioreator.

Parte do vídeo explicativo do time da Unicamp de 2009. Uma pequena esquematização de como usaram quorum sensing.

Aprender como uma população de microrganismos de comunica é extremamente útil para saber como ela se comporta, e no caso da biologia sintética, muito útil para conseguir controlar esse comportamento para transmitir informações em um dispositivo gênico sintético. Mas é claro que prever todo um comportamento de um sistema biológico não é nada fácil. Como já salientava Asimov, há algo em comum no comportamento de humanos e átomos: ambos são muito previsíveis singularmente, mas praticamente caóticos quando em coletivo. Apesar de mais simples, populações de microrganismos também se comportam assim, o que é uma das razões que tornam o trabalho em laboratório muitas vezes frustante e cansativo. Um guia nesse caos é essa compreensão sistêmica da comunicação entre bactérias (que origina certas resistências a antibióticos inesperadas e outras coisas bizarras), que assim como seres humanos, as torna seres mais sociais do que você possa imaginar.

Referências

  1. Whitehead, N. (2001). Quorum-sensing in Gram-negative bacteria FEMS Microbiology Reviews, 25 (4), 365-404 DOI: 10.1016/S0168-6445(01)00059-6
  2. Atkinson, S., & Williams, P. (2009). Quorum sensing and social networking in the microbial world Journal of The Royal Society Interface, 6 (40), 959-978 DOI: 10.1098/rsif.2009.0203
  3. He YW, & Zhang LH (2008). Quorum sensing and virulence regulation in Xanthomonas campestris. FEMS microbiology reviews, 32 (5), 842-57 PMID: 18557946

 

SB 5.0 – Encontro Internacional de Biologia Sintética e um breve histórico

Em julho do ano passado, cientistas do J. Craig Venter Institute “criaram” a primeira célula bacteriana sintética e auto-replicante, controlada por um genoma quimicamente sintetizado e o anúncio foi feito em maio (veja o vídeo abaixo). A equipe sintetizou um cromossomo de 1,08 milhões de pares de bases a partir de um genoma modificado de Mycoplasma mycoides. A célula sintética recebeu o nome de Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 e é a prova de que genomas podem ser desenhados (no sentido de designed) em computadores, depois sintetizados quimicamente em um laboratório e inseridos em uma célula, de forma a produzir uma nova célula auto-replicante controlada apenas por um genoma sintético.

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A notícia se espalhou pelo mundo em pouco tempo, ganhando fama, criando polêmica e dividindo opiniões a respeito dos riscos e benefícios potenciais de sua descoberta. Em resposta, o Presidente Barack Obama pediu para a “Presidential Commission for the Study of Bioethical Issuesavaliar o desenvolvimento e a ética da biologia sintética e tecnologias emergentes, de forma a maximizar os benefícios e minimizar os riscos. A Comissão contou com o engajamento de cientistas, engenheiros, profissionais ligados à ética, ciências sociais.

Agora em junho, cerca de 700 pessoas de 30 países participaram do 5ª Encontro Internacional de Biologia Sintética na Universidade de Stanford, que pelo que me parece é o mais importante nessa área. Havia cientistas superstars, estudantes, biólogos DIY, engenheiros, biólogos tradicionais, entre outros. O pessoal que segue nosso twitter ou a página do facebook ficou sabendo que a conferência foi transmitida ao vivo pela internet e viu como esse pessoal está batalhando para dar os próximos passos na synbio.

A criação da célula sintética abre portas para um futuro no qual biólogos sintéticos poderão “redesenhar” (redesign) células vivas para realizarem quaisquer tarefas desejadas. A maior parte das pesquisas atuais tem focado em bactérias que executam atividades semelhantes àquelas que elas já fazem, por meio de processos e materiais que se parecem com aqueles utilizados naturalmente. Exemplos são bactérias produtoras de combustíveis.

Os cientistas têm as ferramentas necessárias para editar uma sequência genética existente em um computador, usar máquinas sintetizadoras de DNA para fabricar os fragmentos e uni-los em laboratório (Esse é só um de vários caminhos que biólogos sintéticos estão tomando.) Mas ainda é difícil predizer o que as células farão depois de serem alteradas. Pesquisadores enfrentam desafios porque as células tem um “desejo natural” de crescerem e viverem à sua maneira, mas elas precisam aprender a produzir algo útil de uma forma eficiente.

Um dos maiores obstáculos reside na criação e montagem dos fragmentos de DNA que codificam para uma função particular e são sintetizados no laboratório. Fabricar esse DNA ainda é caro e requer tempo, e qualquer outra mudança que seja necessária demanda ainda mais tempo e dinheiro.

“Algumas sequências são sintetizadas em dois meses”, enquanto outras podem nem mesmo serem feitas, por razões ainda não entendidas, disse Reshma Shetty, co-fundadora do Ginkgo Bioworks, uma companhia que monta partes de DNA.

Pamela Silver, uma professora de biologia de sistemas da Universidade de Harvard, acredita que os biólogos do futuro poderão sentar na frente de um computador, planejar um experimento, e ter o DNA no dia seguinte. Para que a biologia sintética cumpra sua promessa, a síntese de DNA deve ser barata, rápida, previsível e acurada, além de ser disponível a todos, incluindo pesquisadores cujos laboratórios não tem equipamentos ou recursos apropriados. Felizmente, o custo da síntese de DNA, assim como o do sequenciamento de DNA, vem caindo rapidamente.

Retirado e adaptado de: What’s the Future of Synthetic Biology? por Katherine Bourzac

Para Saber Mais:

The Promise of Syn Bio (version 5.0)

First Self-Replicating, Synthetic Bacterial Cell Constructed by J. Craig Venter Institute Researchers 

Immaculate creation: birth of the first synthetic cell

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Secretaria de Partes Biológicas Padrão

Já comentei em posts anteriores sobre os Biobricks, as partes biológicas padrão da biologia sintética. Dentro desse contexto, foi fundado em 2003, no MIT, a Secretaria de Partes Biológicas Padrão (Registry of Standard Biological Parts) para depositar as partes genéticas utilizadas na montagem de dispositivos e sistemas sintéticos. A secretaria contém mais de 3400 partes que podem ser trocadas por inúmeros laboratórios cadastrados e espera-se que todos contribuam com dados e novas partes para melhorar o repositório.

A secretaria oferece muitos tipos de partes biológicas, incluindo plasmídeos, primers, promotores, domínios de proteínas, sítios de ligação de ribossomos, riborreguladores, genes repórteres e etc… (veja a lista).

Entre os objetivos de criação do Registro estão: (i) possibilitar a engenharia sistemática da biologia, (ii) promover o desenvolvimento transparente e aberto de ferramentas de engenharia biológica e (iii) para construir uma sociedade que, produtivamente e democraticamente, possa aplicar tecnologias biológicas.

Atualmente mais de 120 laboratórios do mundo inteiro pertencem à comunidade dos Biobricks. Este ano, o Laboratório de Bioprodutos da USP foi o primeiro laboratório do país a fazer parte dessa comunidade. Algumas das nossas construções genéticas já  estão sendo feitas em formato biobrick para que possamos receber partes e contribuir com partes também. Na próxima segunda, receberemos uma das responsáveis pela Secretária, Meagan Lizarazo que irá dar uma palestra sobre biologia sintética, biobricks, iGEM e outros assuntos relacionados.

Não percam esta oportunidade!

BioBricks: fabricação de pequenos fragmentos de DNA

Este protocolo é utilizado para a fabricação de BioBricks pequenos, como promotores ou sítios de ligação do ribossomo (RBS). Para isso, utiliza o anelamento e extensão dos primers para criar um pequeno fragmento de DNA (~ 100 bp) utilizando Taq polimerase de alta fidelidade. O fragmento de DNA pode ser imediatamente utilizado em uma reação de clonagem utilizando TOPO-TA. Caso se deseje realizar uma etapa de digestão do fragmento de DNA, uma etapa de purificação de produto de PCR é necessária.

Materiais:

– Dois primers que se sobrepõe por ~20 bp.

Primer 1:    5′ ———————————– 3′
Primer 2:                                        3′ ———————————– 5′

Mix para PCR Taq alta fidelidade

Método

1. Diluir os dois oligos a uma concentração de 25 μM utilizando H2O. Para primers maiores que 50-60 bp podem ocorrer problemas como erros e deleções, por isso, pode valer a pena incluir uma etapa de purificação extra PAGE (Invitrogen).

2. Misturar os reagentes em um tubo estéril de 0.6 mL:

  • 9 μL PCR supermix
  • 0.5 μL primer 1
  • 0.5 μL primer 2

3. A reação de anelamento e extensão dos primers ocorrem no termociclador segundo o seguinte protocolo:

  1. 94°C por 5 mins
  2. 94°C por 30 seconds
  3. 55°C por 30 seconds (ou qualquer outra temperatura de anelamento)
  4. 72°C por 30 seconds
  5. Repita os passos 2-4 por 2-3 ciclos
  6. 72°C por 5 mins

4. Utilize 1μL de produto de PCR fresco (feito no mesmo dia) numa reação de clonagem com TOPO TA cloning.

Para desenhar um BioBrick por esse método não se esqueça de colocar o prefixo e sufixo dos BioBricks nos primers. Pronto, já descrevemos os protocolos para desenhar e montar um circuito sintético com promotores, RBS e genes.

Boa sorte e qualquer dúvida, por favor, pergunte!

Referências

Stemmer WP, Crameri A, Ha KD, Brennan TM, and Heyneker HL. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene 1995 Oct 16; 164(1) 49-53. pmid:7590320. PubMed HubMed PubGet [Stemmer-Gene-1995].

http://openwetware.org/wiki/Knight:Annealing_and_primer_extension_with_Taq_polymerase

BioBricks: fabricação de uma parte padrão.

Até agora comentamos sobre a possibilidade de juntar diferentes componentes utilizando o padrão técnico de montagem dos BioBricks. Mas neste post vou comentar sobre a fabricação de uma parte padrão. No futuro, eu pretendo comentar sobre a síntese de DNA sintético, mas agora vou explicar como montar um BioBrick utilizando o método de PCR. O aparelho para realizar um PCR, o termociclador, está presente na maioria dos laboratórios de biologia molecular, e hoje se apresenta como uma ferramenta básica para este tipo de atividade. Existem centenas de livros e sites na Internet que podem te familiarizar com a técnica. Primeiramente, um BioBrick pode ser construído via PCR se existe algum molde de DNA do qual o BioBrick possa ser amplificado (por ex., um gene de alguma bactéria) ou se a parte é pequena o suficiente que possa ser criada através do alinhamento e extensão do primer (iniciador). Nos dois casos é necessário adicionar na extremidade 5′ dos primers as sequências referentes aos sítios das enzimas de restrição presentes nos BioBricks, os sufixos e prefixos (ver post anterior).

A construção de BioBricks contendo sequências codificadoras de proteínas requer um sufixo e um prefixo um pouco mais especializados por duas razões:

1. o prefixo é alterado para garantir o espaçamento entre o sítio de ligação do ribossomo e o códon ATG de início.

2. BioBricks que codificam proteínas possuem, por padronização, dois códons de sequência TAA de parada.

Ao construir os primers, basicamente, é necessário “copiar e colar” a seguinte sequência de 31 bp no fim 5′ no seu primer upstream (ou iniciador universal) desenhado para o seu fragmento de DNA de interesse:

5′ —> 3′
GTT TCT TCG AAT TCG CGG CCG CTT CTA G ATG…
start codon (no caso de um gene)
E “copiar e colar” os seguintes 35 bp no fim 5′ do seu primer downstream (iniciador reverso):

5′ —> 3′
GTT TCT TCC TGC AGC GGC CGC TAC TAG TA TTA TAA….
duplo stop codon!

A estas sequências deve-se somar aproximadamente 20 bp de sequência de primer relativa a região codificadora. Para este tipo de clonagem se utiliza uma Taq polimerase com alta fidelidade e um kit de clonagem TOPO-TA cloning.

Claro que todas as outras precauções para se desenhar um primer ainda são válidas, como a verificação de sítios de restrição nas sequências. Para mais detalhes, veja o protocolo disponibilizado para a fabricação de BioBricks.

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