CRISPR: nova e revolucionária técnica para edição de genoma


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Ter o genoma sequenciado por apenas 1000 dólares em breve será uma realidade. E não é somente ler o genoma que está se tornando cada vez mais acessível, descobertas recentes resultaram em uma nova ferramenta de edição de genoma que promete revolucionar a pesquisa médica e o tratamento de algumas doenças. Este mecanismo, chamado de CRISPR, é baseado num sistema de defesa contra vírus, uma espécie de sistema imunológico, encontrado em bactérias. E mais uma aprendemos algo interessante com estes seres unicelulares (discutimos num post anterior como bactérias podem ajudar a combater o cancer).

Editando o genoma para curar doenças

Tornar o tratamento de desordens genéticas é sem dúvida uma das mais excitantes possibilidades desta nova técnica, principalmente disordens causadas por uma ou poucas mutações, tais como doença de Huntington. Para comprovar que isto pode ser feito, cientistas do MIT, em experimentos em camundongos, conseguiram curar em uma doença rara que ataca o fígado e é causado pela mutação de apenas um par de base de DNA. Esta doença, que também ocorre em humanos, afeta 1 em cada 100.000 pessoas e consiste na falha da quebra do aminoácido tirosina que acumula e afeta o funcionamento do fígado. Utilizando a técnica de CRISPR os cientistas conseguiram corrigir o gene para 1 em cada 250 células do figado (hepatócitos) dos camundongos. Depois de 30 dias estas células proliferaram e substituiram parte das células com o gene defeituoso chegando a um terço da população total de células, o que foi suficiente para curar a doença. Veja o artigo publicado na Nature.

Mecanismo básico das ferramentas de edição de genoma

crisprBasicamente, o mecanismo de edição de genoma consiste em um sistema para reconhecer o sítio onde haverá a mudança combinado a um mecanismo de corte do DNA (nucleases). Uma vez reconhecido o local de corte as nucleases agem fazendo um corte nas duas fitas do DNA. Uma vez cortado, mecanismos de reparação do genoma tendem a juntar as fitas novamente e neste processo um pedaço de DNA pode ser removido ou até mesmo trocado por outro pedaço de DNA.

As primeiras técnicas desenvolvidas, tanto Zinc finger nucleases quanto TALEN, utilizam proteínas para reconhecer o sítio de corte no genoma. Proteínas são pesadas e díficeis de projetar, diferentemente de RNA que pode ser facilmente sintetizado. E é aí que está a grande inovação da técnica de CRISPR, em utilizar pequenos pedaços de RNA para identificar o sítio de corte, o que torna a técnica simples e de baixo custo.

Recomendo os seguintes vídeos/animações para uma ilustração do mecanismo de edição de genomas. O primeiro video (em inglês) fala um pouco sobre os mecanismos gerais destas técnicas. O segundo vídeo (também em inglês) ilustra o mecanismo baseado na CRISPR.

Referência:

Cong, Le, et al. “Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.”Science 339.6121 (2013): 819-823.

Hwang, Woong Y., et al. “Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.” Nature biotechnology 31.3 (2013): 227-229.

Bactéria Sintética Segundo Craig Venter

Autor: Mira Melke

O Anúncio da criação da bactéria sintética pelo J. Carig Venter Institute  (JCVI) foi há pouco mais de dois anos, em 2010. Na época, cientistas de várias regiões do mundo e de áreas distintas se pronunciaram a respeito do que o Próprio Venter chamou de “A Criação de uma nova vida”. Afirmação extremamente questionável, mas que movimentou a mídia como poucos cientístas conseguiram fazer até hoje. Essa afirmação foi tema do meu trabalho para a disciplina de Filosofia da Biologia e resolvi compartilhá-lo com vocês.

A base do meu trabalho foram dois artigos. O Primeiro deles é o publicado pela Science e pelo grupo do JCVI, intitulado “Creation of a Bacterial Cell Controled by a Chemically Synthesized Genome”. Reporta o design  síntese e organização de um genoma completo de uma bactéria. Esse genoma foi posteriormente transplantado em uma bactéria que teve seu material genético extraído por completo.

O segundo, publicado pela Nature, apenas 7 dias depois, intitulado “Life After the Synthetic Cell” traz a opinião de oito especialistas na área da Biologia Sintética sobre as implicações para a ciência e para a Sociedade da “Célula Sintética” feita pelo JCVI.

Ambos os artigos podem ser encontrados facilmente no pubmed.

Antes de entrarmos propriamente na discussão filosófica, quero apresentar brevemente a proposta do trabalho  e a metodologia utilizada.  Na apresentação, está resumida em apenas um slide, mas quero detalhar um pouco de cada etapa.

Minimização do Material Genético

Essa etapa consistiu em determinar, a partir de dois organismos simples (duas cepas (linkar uma referência explicando a palavra cepa) de Mycoplasma mycoides) com o genoma conhecido.  Muitos anos foram necessários para estabelecer o conjunto de genes que era estritamente necessários para a sobrevivência da bactéria. 100 de 485 genes testados foram considerados dispensáveis quando inibidos um de cada vez.

Design do Genoma

A combinação do resultado da minimização com algumas sequências de controle (watermarks) formou o genoma base para a síntese.  Ele precisava conter apenas os genes essenciais para a  sobrevivência da bactéria, ainda que o papel desses, individualmente,  não tivesse sido elucidado.

O design da sequência foi realizado digitalmente.

Síntese em Quatro etapas

Essa síntese foi, de fato, o grande feito realizado pelo grupo. Eles “montaram” a partir de  partes sintéticas bem pequenas um genoma com 1.08 mega pares de bases.  No primeiro estágio, 10 cassetes de 1080 pb sintetizados (overlapping  synthetic oligonucleotides) foram combinados, formando 109 assemblies de aproximadamente 10kb – setas em azul. Esses, em grupos de 10, foram recombinados para produzir os assemblies com aproximadamente 100 kb – setas em verde. Na etapa final, 11 desses foram combinados para produzir o genoma completo – circulo vermelho. Essas etapas foram realizadas, primeiramente em E.coli, as etapas finais, foram realizadas utilizando leveduras.

Para um melhor entendimento dos processos, recomendo que vá direto ao paper. Algumas leituras auxiliares podem ser necessárias.

Transferência do Genoma

O genoma sintetizado e montado foi transplantado em uma bactéria recipiente (Mycoplasma capricolum) que teve seu material genético totalmente removido. Toda a maquinália celular ( enzimas, organelas,membranas) estava intacta. Dessa forma, os elementos que seriam controlados pelo novo genoma e que atuariam sobre ele estavam presentes. Observe também que o gênero das bactérias (a que serviu como base para o genoma e a que recebeu o material genético sintetizado) é o mesmo. Sendo assim, é esperável que não haja rejeição ao novo material genético e morte da célula.

Após todos esses processos e análise do sucesso do transplante  a “nova” bactéria foi capaz de auto-replicação e apresentou o crescimento logarítmico característico das bactérias. Algumas mutações ocorreram durante o processo, mas essas não alteraram o desempenho da célula. Dessa forma, foram mantidas.

Depois de milhares de replicações celulares, as características da célula, bem como todos os seus componentes celulares eram derivados do novo genoma sintetizado, não guardando nenhuma informação da célula recipiente. Com isso em mente, os cientistas do JCVI afirmaram que de fato, criaram uma célula sintética.

Tal afirmação foi extensamente questionada por boa parte da comunidade científica. Para não alongarmos muito a discussão, aconselho que sigam pela apresentação, e observem as opiniões e divergências sobre o assunto.

Minha opinião também se encontra a apresentação e estou disponível para continuarmos essa conversa pelo comentários, caso se sintam a vontade. Em caso de dúvidas, comente.

Apresentação disponível em: http://prezi.com/veskghxybqgv/nature-entra-na-discussao/

Um Abraço.

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