Synbio na terra da Mafalda

Autor: Ivan Lavander, estudante de Ciências Biológicas – USP

Entre os dias 16 e 22 de abril rolou um curso introdutório de biologia sintética, o primeiro desse tipo na America Latina, hosteado pela Universidade de Buenos Aires e financiado pela Organização Europeia de Biologia Molecular (EMBO). Eu fui um dos participantes selecionados, e vou divulgar numa série de posts um pouco do que rolou por lá =)
Esse é um primeiro post sumarizando o curso, e os próximos posts com a sigla [SBAr] se referem ao conteúdo do curso!

Estrutura do Curso – O curso se focou em introduzir os participantes nos principais métodos, estratégias e desafios do synbio. Mesmo nessa fase inicial, algumas idéias e principios já se definem como parte essencial da biologia sintética, incluindo quatro principais tópicos: estratégias bottom-up, top-down, algumas filosofias malucas sobre biobricks e aplicações. Durante o curso, esses tópicos e seus respectivos objetivos foram distribuídos abordados da seguinte forma:

(1)   Da complexidade natural à artificial;

Antes de desenvolver novos circuitos, é preciso se entender a organizaçào e “robustez” dos circuitos naturais. Integrar os dados de bancos de dados, assim como o montante de dados gerados por tecnologias de “high throughput”, que geram quantidades absurdas de dados, possibilitam observar com grande profundidade a dinânica do genoma, transcriptoma, proteoma, metaboloma e suas interações. Como selecionar e aplicar essa montanha de informação originária da natureza e quais métodos devem ser utilizados para otimizar essas redes de informação em circuitos sintéticos?

(2)   Estratégias bottom-up;

Bottom-up, ou “de baixo pra cima”, é a estratégia usado pra construir coisas com legos: usar partes intercambiaveis e bem conhecidas que podem ser utilizadas para se desenvolver sistemas de diferentes complexidades (em contraposição a estratégias top-down, onde mal se conhece o funcionamento do sistema, quanto mais sua complexidade, mas é preciso regula-lo para combater doenças, por exemplo). Esse jeito bottom-up de fazer synbio é uma das areas mais revolucionárias em synbio, trazendo uma nova visão open source de como produzir ciência. Assim, tem-se elevado, através da constante caracterização de novas partes biológicas, a complexidade e potencial de desenvolvimento de novos circuitos biológicos sintéticos pela utilização desses legos biológicos.

(3)   “Life is computation!”;

Modelos físicos teóricos predizem e eu não entendo porra nenhuma com bastante precisão sistemas complexos, e tem ajudado a revelar mecanismos antes inimagináveis de controle de expressão gênica. Esses modelos ajudam a guiar o design de circuitos sintéticos e a otimiza-los.

(4)   Interfaces entre circuitos sintéticos e naturais;

Diferente da estratégia bottom-up, alguns circuitos de interesse são extremamente complexos, dependem de fatores externos ou suas “partes” são pouco conhecidas – pelo menos com quanto as diferentes interações possíveis. Uma estratégia top-down, “de cima pra baixo”, permite regular sistemas biológicas sem que cada parte envolvida tenha sido “reconstruída” ou, no mínimo, seja totalmente conhecida como no caso de biobricks. Seria como desativar, ativar ou modular alguma parte pra ver se continua funcionando ou o que deixa de funcionar. E essa é uma das grandes promessas e revoluções do synbio: usar circuitos sintéticos em interface com circuitos complexos naturais para controlá-los ou modulá-los.

Os participantes 

A organização do curso foi feita pelos professores da Universidade de Buenos Aires Dr. Alejandro Nadra, o Dr. Ignacio Sanchez (o nacho!) e o Dr. Raik Grünberg, da Alemanha, todos advisors do primeiro time argentino do iGEM <http://igem.qb.fcen.uba.ar/site/#page_2/> e que vao ganhar um espaço próprio num futuro post.

Os palestrantes, Dr. Marc Güell, pos doc no Church lab em Harvard, e a Dra. Reshma Shetty, co-fundadora da Ginkgo Bioworks http://ginkgobioworks.com/, uma start up de synbio norte americana, falaram sobre a integração de bancos de dado e otimização de redes naturais para se criar circuitos artificiais. O Dr. Drew Endy (primeiro comentário: imagina um cara com cara de gringo, segundo: dizem por aí que ele é “o próximo steve jobs”) co-fundador da BioBricks Foundation e um dos idealizadores do iGEM, falou sobre estratégias bottom-up e biobricks ohreally?. O Dr. Roman Jerala (o principal advisor do time da Slovenia que ganhou duas vezes o grand award do iGEM) e a Dra Chirstina Smolke (uma das principais pesquisadoras de switches de RNA e professora de bioengenharia em Stanford) falaram sobre modulação de circuitos naturais usando estratégias de top-down (DNA origami, riboswitches, proteínas fusionadas) e o Dr. Thierry Mora e a Dra. Aleksandra Walczak mostrou o que a França tem de melhor, ambos da Ecole Normale Supérieure e do CNRS, falaram sobre modelagem teórica de redes complexas e aspectos teóricos do design de circuitos gênicos.

Mais informações:

http://events.embo.org/12-synthetic-biology/

Entenda a Engenharia Metabólica

ResearchBlogging.orgUma das grandes maravilhas da humanidade – objeto de grande satisfação entre os químicos – é uma tabela que nos diz tudo o que existe no universo, os cerca de 120 elementos que formam tudo aquilo que o ser humano conseguiu perceber. Usando essa mesma ideia, cientistas conseguiram determinar 12 substâncias principais que podem produzir tudo… o que existe dentro de uma célula! Esse é um dos princípios fundamentais da Engenharia Metabólica, entenda o porquê:

Os 12 Precursores Principais

Tudo o que uma célula consome sempre produz compostos que chamamos de “precursores principais”. São esses precursores que podem gerar tudo dentro da célula: desde seu DNA até às membranas celulares. Na bactéria E.coli, por exemplo, existem 12 dessas substâncias principais: Eritrose 4-fosfato, o famoso Acetil CoA,  Frutose 6-fosfato, Glucose 6-fosfato, Alfa-cetoglutarato, Oxaloacetato, Ribose 5-fosfato, Fosfoenolpiruvato, 3-fosfoglicerato, Piruvato (esse carinha é famoso também), Triose-fosfato e Succinil CoA. Isso quer dizer que a grande maioria de todas a milhares de reações dentro da E.coli em algum momento formam e/ou consomem essas substâncias em suas etapas de reação.

Assim, ao melhor estilo dos antigos alquimistas, pesquisadores – em especial FC Neidhardt – dissecaram células de E.coli de modo a determinar a quantidade desses precursores que seria necessária para “construir” uma bactéria (ver infográfico acima):

Ou seja, todos os precusores somados às moléculas para se realizar oxidações (NAD), reduções (NADPH) e fornecer energia (ATP), resultam em 1 mol de “XR”, que é a quantidade de biomassa produzida com esses compostos, ou “1 mol de células” (definida aqui como a quantidade de células em 10^6g). XR seria um arcabouço que abarca todas as proteínas,  lipídeos e  nucleotídeos da célula; por isso não podemos dizer que essa é de fato uma equação química, mas uma “pseudo-equação química”, afinal dá pra ver claramente que as quantidades das substâncias não se conservam em termos estequiométricos – pra falar a verdade, não há nem a representação de elementos, são só siglas.

Enfim, esse é o mais próximo que chegamos do desejo dos alquimistas de obter uma receita para a vida como eles idealizaram, mas apesar de parecer pouco, essa pseudo-reação global de “construção de células” nos permite contabilizar literalmente quais são os recursos que as bactérias têm para produzir coisas que não produzem natualmente, ou seja, nos mostram quais são as cartas em jogo quando se altera um organismo geneticamente. E o nome desse jogo é fluxo, fluxo metabólico.

O Fluxoma

Uma célula é como se fosse uma mini indústria: seus operários são enzimas, a chefia é a informação genética e a matéria prima são os metabólitos externos com o qual se produzem as peças – que são os 12 metabólitos principais – para a linha de montagem: as etapas de reações bioquímicas. Essa pequena empresa é um empreendimento talhado pelo mercado competitivo, ditado pela economia minimizadora de enegia, seguindo a lógica da seleção natural. Igualzinho às empresas de verdade. Mas enfim, a grande pergunta é: o que acontece quando a chefia muda? O que acontece quando modificamos geneticamente um microrganismo? Apenas colocar uma informação genética não natural na “chefia” é o mesmo que colocar um administrador inexperiente no comando de todo um processo produtivo que ele não conhece. É ir contra milhares de anos de seleção natural.

Arte de Pedro Pantai. Visite http://meninodacaixadesapato.blogspot.com.br/

Por exemplo, imagine que a nossa célula é uma fábrica de motos. Depois de muitos anos existindo, decidem colocar uma nova chefia adjunta no comando. O novo chefe adjunto decide colocar uma nova maquinaria e funcionários no chão de fábrica, pois quer ampliar a gama de produtos que a empresa fabrica. A indústria de motos então passa a produzir triciclos; nada mal. O problema é que a nova chefia SÓ faz isso. Ele não comunica os antigos funcionários sobre a nova produção, não compra mais matéria prima e, apesar de desejar que o carro chefe da empresa seja triciclos, não move uma palha para que isso aconteça. Em outras palavras: temos uma fábrica de motos que improvisa na fabricação de triciclos. É aí que entra o engenheiro de produç… Ops, o “engenheiro metabólico”.

O grande problema da nossa indústria de motos é apenas de distribuição das peças, afinal – simplificadamente – a grande diferença do produto antigo para o novo é apenas uma roda. Da mesma maneira, em uma célula a grande diferença entre os componentes que ela já produz para existir (o “XR” da pseudo-reação acima) e as novas substâncias que queremos que ela produza (por modificações genéticas) é apenas uma combinação de quantidades diferentes dos 12 precursores principais que levem às reações de síntese que queremos. Para ter controle dessas reações que levam à XR e/ou ao bioproduto desejado, cria-se o chamado “fluxoma”, a contabilização de todos as taxas de reação (os fluxos) de dentro da célula – da mesma forma que o genoma é a contabilização de toda a informação genética de uma célula.

ATENÇÃO: se a matemática não é sua amiga, tome cuidado com o conteúdo a seguir.

Fluxos Metabólicos

A teoria que se aplica para a determinação desses fluxos baseia-se na simples conservação de masa em um sistema fechado, no caso uma célula ou um compartimento celular fechado com metabólitos; especificando a reversibilidade das reações e quais metabólitos são considerados como internos e externos. A equação geral que descreve a conservação de massa de metabólitos em um sisema de volume definido pode ser escrita como:

Em que C (mol/L) é um vetor da concentração de m metabólitos internos; r ((mol/L)/h) é o vetor do grau de reação, ou seja o fluxo,  de n reações que convertem metabólitos; S é a matriz estequiométrica de dimensões  m x n cujos elementos sij representam o coeficiente estequiométrico do elemento i envolvido na reação j; e μ (1/h) é o grau específico de diluição associado com a mudança no volume de um sistema, o que é muito importante considerar no modelo, pois o graus de diluição afetam diretamente as velocidades de reação. Como em uma célula o grau de diluição é muito baixo quando comparado com os graus de reação, as mudanças de volume no sistema são consideradas negligenciáveis. Temos portanto a equação mais simplificada:

Em um estado estacionário, que é o que se considera na análise de um fluxo metabólico, não há acúmulo de metabólitos, e portanto suas concentrações, bem como a população bacteriana, tornam-se constantes, fazendo com que dC/dt = 0:

A caracterização de reações reversíveis é realizada através da detreminação do sinal de ri, em que ri < 0 delimita a reação ocorrendo no sentido oposto, ri = 0 informa a sua não-ocorrência e ri > 0 indica uma reação ocorrendo no sentido esperado.

Uma outra maneira mais simplista de se entender o mesmo raciocínio, partindo do mesmo princípio de conservação de massa, pode ser:

O que é o mesmo que S.r = 0. Considerando as substâncias envolvidas em várias reações, teremos o mesmo resultado:

OBSERVAÇÃO: Aqui acaba o conteúdo matemático. Pode continuar a ler abaixo, já passou…!

Análise de Vias Metabólicas

Então, como dá pra perceber, tudo se resume a encontrar um sistema de equações – sim, os sisteminhas de equações que você aprende a resolver na escola – que descreva o metabolismo da célula envolvendo os metabólitos principais. É exatamente aqui que entram os dados da pseudo-reação global comentada no início, é ela que define, junto com dados experimentais de consumo de substratos, o conjunto de soluções desse sistema de equações (chamados de “modos elementares”). Os sistemas de equações obtidos por análise das vias metabólicas são sempre indeterminados, uma vez que o número de reações bioquímicas as envolvendo é muito maior que o número de espécies de metabólitos, ou seja: tem-se mais equações que variáveis. A tarefa de programas de análise de vias metabólicas é encontrar possíveis soluções para esse sistema que digam quais são os possíveis fluxos de todas as reações envolvidas, com isso é possível analisar qual modo elementar é o que possui maior rendimento de produção do bioproduto desejado, e portanto quais reações que devem ocorrer no sistema em detrimento de outras.

Por exemplo, vejamos o exemplo da produção de Lisina em Corynebacterium glutamicum. Esse aminoácido é naturalmente produzido em nível basal na célula para manutenção da atividade celular, apenas super-expressando os genes envolvidos nas vias de produção de lisina e nocauteando outros genes que produzem enzimas competidoras (essas são grandes maneiras de se alterar os fluxos metabólicos) da biosíntese de lisina é possível aumentar cerca de 11 vezes a produtividade. Isso pode ser feito sem análise nenhuma. Mas se analisando os fluxos metabólicos (imagem abaixo), vemos que é possível quase dobrar a produção industrial de Lisina à partir da mesma quantidade de glicose. Assim como na analogia entre a indústria e a célula, única diferença foi a distribuição dos fluxos entre os precursores principais da C. Glutamicum, ou seja uma combinação diferente de quantidades dos precursores em diferentes reações.

No caso, um aumento do fluxo metabólico pela via das pentoses (formando Ribulose 5-fosfato) em um processo sem produção de CO2 – realizando o ciclo do glioxilato – aumenta a produção por gerar mais NADPH, necessário na biosíntese de Lisina, e que não é produzida na via “normal” de degradação da glicose (via de Embden-Meyerhoff-Parnas).

O Futuro da Engenharia Metabólica

Muitos dizem que a engenharia metabólica será tão eficiente em otimizar os processos biotecnológicos que substituirá completamente os processos químicos orgânicos no futuro, afinal esse é o grande entrave para termos toda uma indústria baseada em uma bioprodução: os processos químicos são muito mais eficientes. Ter toda a indústria química baseada na produção de materiais por organismos nos daria um mundo mais ecológico e renovável. O grande passo para isso já foi dado com a “synthia“, a bactéria sintética de Craig Venter e seu grupo. O desafio de se fazer engenharia metabólica é justamente o problema que foi eliminado – EDITED: OK, não eliminado, mas amenizado – quando se nocauteou todos os genes não essenciais para a sobrevivência na bactéria produzida por Venter, pois qualquer nova via colocada no microrganismo já estaria quase completamente otimizada, uma vez que não existiriam fluxos “não essenciais” em que a bactéria poderia estar “desperdiçando” energia em vez produzir o bioproduto dos genes com que foi modificada. Assim, como um upgrade da engenharia genética, a engenharia metabólica faz aquilo que torna a Biologia Sintética algo simples e bonito: apenas uma mudança inteligente de como a informação é transmitida; uma mudança de design. No final das contas, mais do que pseudo-realizar os sonhos dos alquimistas, entender os fluxos metabólicos é mudar a maneira como os químicos atuais sonham com o futuro, afinal, porque reinventar como produzir substâncias orgânicas se os próprios organismos podem fazer isso pela gente!? Já está mais do que na hora de reinventarmos nossa indústria.

Referências

Vallino JJ, & Stephanopoulos G (2000). Metabolic flux distributions in Corynebacterium glutamicum during growth and lysine overproduction. Reprinted from Biotechnology and Bioengineering, Vol. 41, Pp 633-646 (1993). Biotechnology and bioengineering, 67 (6), 872-85 PMID: 10699864

Neidhardt, F. C., J. Ingraham, and M. Schaechter. 1990. Physiology of the Bacterial Cell: A Molecular Approach. Sinauer Associates, Sunderland, MA.

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