Para quem acha, não somos o primeiro grupo a ambicionar ir a um evento do iGEM. Lá pelos idos de 2009 o Brasil participou pela primeira vez da competição representado pela Unicamp, conseguindo trazer aqui para o lado de baixo do hemisfério uma medalha de ouro já “de cara”, equiparando-se às universidades mais renomadas do mundo, como Cambridge, Harvard e outras.

Sob o projeto intitulado “Microguards”, o time brasileiro criou um mecanismo de transformação de E.Coli’s e de leveduras  (S. Cerevisiae) em “micro guardas”, que atacam bactérias contaminantes de biorreatores de etanol, no caso as bactérias do gênero Lactobacillus (do tipo daquelas que regulam a sua ação intestinal quando você bebe o seu leite fermentado – Yakult, Chamyto, e etc -). Usar um mecanismo como esse na indústria brasileira evitaria o atual desperdício de milhares de litros de álcool que deixam de ser produzidos por causa do açúcar consumido pelos microorganismos invasores nos bioreatores de etanol. Cerca de 5 à 10 % da produção é desperdiçada por causa desses ladrõezinhos.

O Mecanismo

Reconhecimento

“ColiGuards”

Criando uma espécie de “sistema imune de bioreatores”, duas linhagens de E.coli’s são criadas no meio de cultivo: a linhagem natural chamada de workers linage e a linhagem de “microguards”, ou killers linage; a população dos dois tipos de linhagem varia dependendo do grau de contaminação do meio, ou seja, quando não há contaminantes, muito poucas bactérias workers transformam-se em killers e vice-versa.

A transformação em killers é ativada por, um metabólito secundário de quorum sensing, AI-2 (se quiser saber mais clique aqui),  que é liberado tanto pela bactéria contaminante quanto pelas E.Coli’s selvagens, é reconhecido pelas E.Coli workers, que não produzem AI-2, o que as induz a diferenciarem-se em killers. Além disso elas podem detectar os contaminates através da conjugação bacteriana com os microorganismos invasores, abilidade que só as killers passam a ter no processo de diferenciação, utilizando-a apenas naqueles microorganismos que possuem um plasmídeo diferente do seu (veja “recognition by conjugation” aqui).

“YeastGuards”

Para as Leveduras o mecanismo de reconhecimento da presença de contaminantes é um pouco mais simples: a produção de lactato provinda do consumo de açúcar dos Lactobacillus é utilizada para ativar gatilhos gênicos – o que somente é possível através da sensibilização das leveduras ao lactato, utilizando uma permease expressa pela levedura para facilitar sua incorporação à célula – que induzem um ataque aos contaminantes.

Diferenciação

Os brasileiros aproveitaram o elegante design feito pelo time francês da universidade de Paris no iGEM de 2007 para criação de um sistema de diferenciação das E.Coli’s em microguards. Com a atuação de uma recombinase (a cre recombinase),  parte dos genes do plasmídeo que transforma o microorganismo sofre excisão, tornando-se um pequeno pedaço de DNA circular com baixa taxa de atividade e sem origem de replicação, enquanto os outros genes que permaneceram no plasmídeo passam a se tornar ativos devido ao seu reposicionamento na fita de DNA logo após um promotor, como pode ser visto na imagem logo abaixo:

Lox71 e lox66 são os sítios do DNA onde atuam as cre recombinases (atuação simbolizada pelo raio vermelho). Após sua ação, os genes após as regiões de terminação (T) são reposicionados - no caso do exemplo o gene dapA - próximos ao promotor que antes era da região excisionada (na imagem o promotor Tet), e por isso tornam-se ativos.

O controle populacional dos microorganismos killers é mantido através do gene ftsK da imagem acima: um gene que produz uma proteína determinante na divisão celular, sendo uma “máquina literal de segregação de cromossomos”. Dessa maneira, evita-se que a população de killers cresça demais e se torne um “tiro pela culatra”, diminuindo a produção de etanol.

Outro aspecto bastante interessante da construção das ColiGuards é o mecanismo de controle de uma população basal de killers em um biorreator não contaminado. Eles usaram uma criativa construção feita por outro time do iGEM, o de Caltech de 2008, que se aproveitou de uma “falha” da atividade da DNA-polimerase para randomizar a expressão de um gene em uma população bacteriana. Essa “falha” é a característica que a polimerase possui de ignorar ou repetir algumas sequências de nucleotídeos que são repetidas longamente no código, produzindo uma cópia de DNA com um número variável dessas repetições (fenômeno chamado de SSM, do inglês: slipped-strand mispairing), a consequência disso é que a sequência codificadora (o gene) pode ser deslocada da posição correta em relação ao seu start codon se as repetições não forem múltiplas de 3 (porque cada códon é constituído de 3 nucleotídeos), e assim a tradução não é feita corretamente. Veja figura abaixo:

As letras maiúsculas correspondem cada uma a um aminoácido, traduzido por um códon (grupo de três nucleotídeos). ATG é o start codon e TAA é um codon de parada formado pelo deslocamento da sequência codificadora. Repare que após uma SSM, uma repetição foi omitida.

Assim, as replicações de DNA que tiverem as repetições múltiplas ATGC múltiplas de três, terão o ajuste correto da região codificadora em relação ao start códon e a tradução correta da cre recombinase será possível:

Alguns tipos de Slipped Strand Mutation que podem acontecer na população de E.Coli's.

Como esse tipo de erro da DNA-polimerase não é tão frequente, apenas uma pequena parte da população se diferenciará em killer se as repetições forem colocadas antes do gene da cre recombinase.

Para diferenciar bactérias workers na vizinhança de contaminantes, todos os microguards possuem uma outra cópia do gene recombinase, mas controlado por um promotor sensível ao AI2 liberado pelos Lactobacillus e pelas Coliguards quando detectam a presença dos invasores (figura ao lado).

Mecanismo de Ataque

A construção desses mecanismos de ataque aproveitou-se da maior diferença estrutural entre as E.coli’s e Leveduras, e o Lactobacillus:  a coli é uma bactéria Gram negativa (possui duas membranas celulares, existindo entre elas uma fina parede celular) e o invasor é Gram positivo (possui apenas uma parede celular no exterior e uma membrana celular interior do compartimento celular), enquanto a parede celular das leveduras é constituída de carbohidratos, diferentemente dos peptídeoglicanos do contaminante. Sabendo disso, o grupo resolveu expressar substâncias que ataquem a parede celular de peptídeoglicanos exposta dos  Lactobacillus e encontraram as lisozimas como a arma perfeita para isso, sendo usadas tanto na secreção como no método kamikaze.

O grande problema dos métodos de secreção é que eles podem se comportar como contaminantes, além da consequente redução do grau de efetividade da enzima durante o tempo devido à seleção natural. A solução encontrada para esse problema foi a conjugação de um plasmídeo (lembrando que somente as killers têm a abilidade de conjugação!) com o gene de uma endonuclease, a colicina, destruindo os Lactobacillus “por dentro”. Para que as próprias E.coli’s não fossem afetadas por esse gene letal, foi inserido um gene de resistência que torna a expressão de colicina inofensiva às Coliguards.

iGEM 2009

Melhor do que descrever como foi o projeto, nada melhor do que as próprias pessoas que participaram do evento para explicarem o que fizeram! Confira a apresentação do grupo brasileiro no Jamboree realizado em 2009 no MIT:

http://youtu.be/P5E5_zPtna4

http://youtu.be/bnaSWT-gdDQ

E nesse ano há outro time em associação com a universidade francesa de Saint-Etienne, com o projeto intitulado “Stress Wars”. Confira o que já está sendo feito nesse novo projeto franco-tupiniquim grupo junto aos outros links interessantes logo abaixo:

• UNICAMP-EMSE team 2011: http://2011.igem.org/Team:UNICAMP-EMSE_Brazil
• UNICAMP-Brazil team 2009: http://2009.igem.org/Team:UNICAMP-Brazil
• Caltech team 2008: http://2008.igem.org/Team:Caltech
• Paris team 2007: http://parts.mit.edu/igem07/index.php/Paris