Light Switches: Um Review

ResearchBlogging.orgJá tratamos nesse blog de um dispositivo simples, mas engenhoso, para a transdução de um sinal luminoso em uma resposta genética desejada, no caso um switch de luz vermelha. Mas podemos abranger o conceito de switch de luz para uma variada gama de mecanismos que a própria natureza esculpiu durante os milhares de anos que teve para se divertir sozinha antes que nós aprendêssemos a modificá-la.

Os mecanismos mais óbvios, que conhecemos bem antes de termos conhecimento da existência de uma célula, são os das plantas. Apesar de pensarmos nesses seres vivos como a fonte mais provável das ferramentas que precisamos para construir um light switch, a biologia sintética utilizou até agora principalmente os dispositivos fotossensíveis de microorganismos fototróficos e quimiotróficos, presentes em uma grande quantidade de bactérias.

As funções de muitos fotorreceptores ainda não são muito claras, mas alguns exemplos na natureza da atividade desses mecanismos vão desde a regulação da motilidade celular, formação de pigmentos, reparo de DNA, resposta ao stress , à até “comportamentos multicelulares”, como a formação de biofilmes e de corpos de frutificação, como por exemplo a Stigmantella aurantiaca.

Corpo de frutificação da Stigmantella aurantiaca.

Corpo de frutificação de Stigmantella aurantiaca. Retirado da publicação de van der Hornst et al, mencionada no final do post.

A grande maioria das proteínas fotossensíveis que a seleção natural pôde criar nesses milhões de anos, e que até agora conhecemos, pode ser classificada em seis famílias bem definidas, baseada na estrutura do cromóforo absorvedor de luz, que podem ser: as famosas rodopsinas, os aqui já conhecidos fitocromos, as xantopsinas, os criptocromos, as também famosas fotropinas e as proteínas de domínio BLUF (blue light sensing using flavin (FAD), domínio utilizador de flavina sensível à luz azul).

A natureza é sutil; ela parte de princípios básicos e com eles (utilizando um bocado de tempo) cria as mais variadas soluções para um mesmo problema. Com os fotorreceptores não é diferente. Uma procura de similaridade de sequências que codificam esses seis tipos de fotorreceptores no mecanismo de busca protein BLAST do NCBI revela uma grande quantidade de sequências similares nos genomas de diferentes espécies, indicando um vasto número de receptores ainda não caracterizados em diversos microorganismos. Um exemplo dessa busca pode ser visto da lista deste link: Chemotrophic organisms containing protein photoreceptor domains.

O princípio básico dos fotorreceptores é: uma estrutura molecular que contenha um ou mais domínios que captam a luz (input) e outro(s) que transforme(m) isso em um sinal intracelular (output). Os domínios de input ligam-se a cofatores ou cromóforos, resultando em uma molécula capaz de absorver luz UV ou visível. O domínio do output pode possuir uma atividade enzimática, proteína-ligante, ou DNA-ligante.  Vejamos alguns domínios de input e de output comumente encontrados in natura.

Domínios de Input Domínios de Output
AppA: Anti-repressor de pigmentos fotossintéticos. O AppA foi a primeira proteína com domínio BLUF caracterizada em Rhodobacter sphaeroides. Absorve na região dos 446 nm com o seu cromóforo FAD. Além de sensível à luz, está envolvida em reações redox.BLUF: Um domínio presente em várias proteínas fotoativas, sua estrutura é similar, mas com um mecanismo funcional totalmente diferente, ao domínio PAS.

LOV: Uma subclasse do domínio PAS, nomeado LOV devido ao tipo de sinal que esse domínio detecta: Luz-Oxigênio-Voltagem (light-oxygen-voltage). Esse tipo de domínio foi descoberto em fototropinas de plantas e mais recentemente em proteínas bacterianas. Um tipo de domínio bem “popular”.

PAS: De “Per-Arnt-Sim”, três reguladores transcricionais que contêm esse tipo de domínio. Outro tipo de domínio bem “popular” no quesito receptor de luz. Muitas proteínas com domínio PAS são conhecidas por transmitir o seu sinal associando-se a cofatores.

Fitocromo: Receptor de luz vermelha e infravermelho encontrado em plantas e bactérias, ligando-se em uma cromóforo de bilina (Lembra do red light switch? A Ficocianobilina é um desses cromóforos).

PYP: De photoactive yellow protein (proteína fotoativa amarela). Um receptor de luz citoplasmático que usa ácido p-coumárico como seu cromóforo. Sua absorção máxima é em 446 nm.

Rodopsina: Proteína composta por um conjunto de sete hélices intermembrana (ver imagem na tabela abaixo), ligando-se a um cofator retinal em seu centro hidrofóbico, absorvendo em maior parte luz verde. Há uma grande quantidade de estudo sobre ela.

YtvA: Um bem caracterizado domínio fotoreceptor de luz azul em Bacillus subitilis. Possui um domínio LOV que se liga ao cromóforo monoflavina (FMN), o que resulta numa absorção máxima em torno de 449 nm.

EAL: Domínio com atividade enzimática diguanilato-fosfodiesterase (traduzindo: envolvido na hidrólise de di-GMP cíclico, um importante sinalizador intracelular). Chama-se EAL por causa de sua sequência conservada de resíduos, mas também conhecido como DUF2.GAF: Domínio com atividade de adenilato-ciclase, guanilato-ciclase, e fosfodiesterase. Liga-se à um cofator bilina em alguns fitocromos.GGDEF: Similar ao EAL, possui atividade de ciclase em diguanilatos (di-GMP). Também possui seu nome devido à sua sequência conservada, conhecido também por DUF1.

HisKA: Domínio fosfoaceptor e dimerizador de proteínas histidina-quinases, importantes proteínas na sinalização intracelular.

HTH: Domínio de ligação ao DNA de reguladores de transcrição bacterianos. Eles se ligam ao DNA via seu motivo (sequência específica de aminoácidos) helix-turn-helix (hélice-dobra-hélice).

STAS: O domínio STAS, cujo nome significa domínio transportador de sulfato e antagonista de fatores anti-sigma (traduzindo: promove a atividade do tal fator de transcrição sigma), é o domínio de output do bem caracterizado YtvA, mas também encontrado em outros fotoreceptores.

Sabendo como as coisas são naturalmente, é possível juntar diferentes peças desse zoológico de domínios proteicos e formar diferentes light switches. Vejamos por exemplo o red light switch: basta juntar um domínio input de fitocromo e um output de ligação ao DNA, no caso o GAL4. Para sintetizar um switch de luz azul, verde, amarelo, e etc, o princípio fundamental é o mesmo: basta montar um input e um output desejados. O resto é pura metodologia e testes. Alguns exemplos de construções naturais podem ser:

Combinações naturais de diferentes domínios Input e Output.

Imagem modificada retirada da referência deste post (van der Hornst et al.).
 

Como se pode ver, o domínio de input LOV parece ser o mais versátil, o que talvez explique a sua “popularidade” no mundo bacteriano dos domínios fotossensíveis. Encontra-se um LOV input ligado à vários tipos diferentes de outputs.

Uma coisa interessante a se levar em conta nessas construções naturais é o tempo de alternância entre os diferentes estados dos fotorreceptores, que como vimos no red light switch, se resume (na maioria dos casos) a um estado “ativo” quando exposto a luz e um “inativo” quando no escuro ou quando passado certo tempo de exposição. Quando o ciclo de mudança do estado ativo para o inativo é um pouco lento, ele é geralmente compatível com regulações na expressão gênica, enquanto graus rápidos de mudança são relacionados com uma regulação comportamental (que não envolve diretamente uma regulação gênica, como por exemplo o aumento da taxa de motilidade de uma bactéria quando exposta à luz). Um ciclo de mudança ainda mais rápido sugere funções bioenergéticas para o fotoreceptor. Isso é um parâmetro importante a se levar em conta no design de dispositivos sintéticos fotossensíveis.

No fundo, talvez grande parte da própria biologia  sintética se resume ao que discutimos aqui: mudança de informação com recombinação. Caímos então no ponto recursivo da biologia. À diferentes níveis e abordagens sempre teremos  a mesma simples metáfora dos blocos de montar: os blocos sempre são os mesmos, o que muda é a informação que colocamos neles ao fazermos diferentes estruturas com diferentes combinações das unidades. Quer um light switch específico que ainda não foi feito? Já está pronto, só basta combinar informação.

Em posts futuros mostraremos como combinar inputs e outputs para criar light switches de outras cores, novamente, com as construções feitas pelos de times de edições passadas do iGEM. Para maiores e melhores informações sobre fotorreceptores, vale consultar o ótimo review de Michael van der Hornst et al:

van der Horst MA, Key J, & Hellingwerf KJ (2007). Photosensing in chemotrophic, non-phototrophic bacteria: let there be light sensing too. Trends in microbiology, 15 (12), 554-62 PMID: 18024131

Como montar o seu próprio laboratório de garagem?

Aqui no SynBio Brasil já foi comentado sobre a onda cada vez mais crescente de pessoas desenvolvendo seus próprios experimentos de Biologia Sintética em suas garagens, o DIYBio. Mas quais são os equipamentos necessários (e mais baratos) para montar o seu próprio laboratório? A revista Nature publicou uma reportagem no ano passado sobre esse assunto e identificou os seguintes equipamentos que não podem faltar em um laboratório de SynBio de garagem:

Equipamentos básicos:

1) Pipetas ($275 – $630): Servem para a aplicação de substâncias com volume controlado

2) Freezer -20ºC ($180 – $500): Serve para refrigerar amostras, culturas, enzimas, etc.

3) Equipamento para corridas de gel ($115 – $190): Identificar e separar fragmentos de DNA ou RNA

4) Shaker ($50 – $400): Serve para misturar soluções

5) Balança ($5 – $3,000): Serve para medir massas

6) Chapa de aquecimento ($100 – $200): Serve para o aquecimento de
soluções

Equipamentos que podem ser improvisados:

1) Autoclave ($250 – $2,000): Esteriliza soluções e materiais

2) Microcentrífuga ($60 – $850): Centrifuga soluções

3) Incubador ($100 – $800): Mantém amostras aquecidas

4) Termociclador ou Máquina de PCR ($195 – $1,000): Faz ciclos de
amplificação de segmentos de DNA

Equipamentos que exigem um investimento alto:

1) Exaustor ($500 – $7,000): Mantém a bancada estéril e livre de
gases tóxicos

2) HPLC ($2,000 – $54,000): Qualifica e quantifica substâncias de
uma amostra

3) Espectrômetro UV/VIS ($180 – $3,000): Quantifica e define a pureza em que uma substância está em uma amostra

Além disso, eu incluiria um pHmetro ($30 – $800), pois é muito importante para a confecção de alguns meios de cultura manter as
condições de pH adequadas ao organismo que será cultivado; além de um microscópio, útil para identificar coisas básicas como o tipo celular que está crescendo em sua cultura, com base na forma ou colorações de Gram.

Para alguns, o preço de certos equipamentos pode parecer um empecilho muito grande no desenvolvimento de um laboratório de garagem, mas a revista mostra exemplos de “Biohakers” que buscaram financiamento para suas pesquisas através de sites solicitando doações com base em seus projetos como o Kickstarter. Outra opção é se unir aos “Engenheiros de Garagem” e montar seus próprios equipamentos! Segundo a revista, é possível fazer um microscópio de $10 adaptando-se a lentes de uma webcam, ou até mesmo dispensar um incubador e aquecer amostras nas próprias axilas (eu mesmo já cheguei a aquecer amostras congeladas de Taq polimerase com as próprias mãos!!!). No Brasil, um bom começo para esse tipo de parceria é a rede social Laboratório de Garagem em que pessoas trocam informações sobre diversas formas de se construir equipamentos com baixo custo.

Com todas essas informações, não há desculpas para os Biólogos de Plantão começarem a botar a mão na massa!!!

Portas Lógicas em Sistemas Gênicos

ResearchBlogging.org

A associação da biologia sintética com a eletrônica é bem grande. A semelhança entre a interação de enzimas, fatores de transcrição e DNA, e circuitos elétricos gera uma interessante conexão interdisciplinar entre engenharia elétrica e biologia, tanto que os próprios fundadores do iGEM e do registry of parts são engenheiros elétricos!

Algumas boas analogias, ou melhor, interpretações dos sistemas gênicos, são feitas com o uso de portas lógicas para classificar o comportamento das interações gênicas. Portas lógicas baseiam-se na lógica booleana, usada largamente em computação. Para entender melhor, vamos ver uns dois exemplos: o NOR e AND.

NOR (“not OR”, o inverso do resultado para a porta OR, conhecido também como NEM):

Imagem retirada e modificada da referência (Khalil, A., & Collins, J.).
 

Como já foi mostrado aqui no blog, esse dispositivo possui dois estados estáveis que podem ser ligados ou desligados através de inputs específicos. Retirando esse input, no caso sinais exógenos como calor e IPTG, o sistema preserva o seu estado, criando assim uma forma molecular não exclusivamente estrutural (i.e. conformação de proteínas e etc) de memória na célula. O raciocínio é o mesmo em eletrônica, como no circuito flip-flop do tipo set-reset, que é capaz de servir como uma memória de um bit em circuitos digitais.

O sistema pode ser interpretado através da tabela verdade de NOR: As entradas são as interações (de repressão ou ativação) do sinal exógeno e do produto gênico, enquanto os números 0 e 1 associados à falso e verdadeiro, podem ser interpretados respectivamente como repressão e ativação nas colunas da entrada, e existência (um) ou não (zero) de
um output na coluna da saída. Então por exemplo, tendo A como o calor (heat) e B como a proteína repressora Cl (produzida por cl-ts) só se terá uma saída (o número 1), ou melhor, um estado estável do toggle (em que é expresso apenas um conjunto de genes), se houver uma interação entre repressões, ou seja, a repressão do repressor, no caso o calor reprimindo a repressão de Cl de lacl, que produz um estado estável de produção de Ptrc2 e GFP (green flourescent protein). Para o outro estado estável, com produção de Cl e repressão do gene lacl, a idéia é a mesma, basta fazer A igual à IPTG e B igual à Ptrc2.

AND (conhecido também por E):

Imagem retirada e modificada da referência (Khalil, A., & Collins, J.).
 

Nesse exemplo, são necessários dois inputs para se obter o output: um de arabinose para transcrever a polimerase T7 com dois stop codons âmbar (é uma classe de stop codons, representada no desenho como pequeninos círculos vermelhos com pontas) no código do seu gene (a polimerase é necessária para expressar o sinal de GFP); e outro sinal de salicilato que promove a transcrição de supD, um RNA transportador supressor de stop codons âmbar. Desse modo, tomando A da tabela verdade como a arabinose, e B como salicilato, pode-se ver claramente que apenas com a ativação da transcrição feita por esses fatores a expressão desses dois genes, pode ocorrer o output de luz fluorescente verde dada pela GFP: o produto de supD suprime os stop codons do gene t7pol, permitindo a transcrição completa de polimerase T7.

Esse é um exemplo de quão sofisticado um sistema gênico pode ser ao se ligar a informação sensorial de múltiplos elementos sensitivos a uma expressão gênica programada. O interessante dessa interface entre engenharia elétrica e microbiologia é a possibilidade de construção de sistemas gênicos com o mesmo princípio de uma série de outros dispositivos já existentes na engenharia, e também o contrário: (porque não!?) usar os dispositivos moleculares que a própria natureza criou e aplicá-los na eletrônica.

Para mais informações sobre outros sistemas bem interessantes, vale ver o review muito legal sobre biologia sintética:

Khalil, A., & Collins, J. (2010). Synthetic biology: applications come of age Nature Reviews Genetics, 11 (5), 367-379 DOI: 10.1038/nrg2775

As 50 empresas mais quentes de bioenergia

Acabou de sair um ranking de empresas que reconhece a inovação e os avanços em  bioenergia. Entre as 50, 37 são dos EUA, 15 são ativas no desenvolvimento do etanol celulósico, 5 desenvolvem algas para soluções energéticas e 16 produzem novos biocombustíveis avançados como o biobutanol,  biodiesel, gasolina e combustíveis de jato renováveis.

Veja a reportagem completa:

http://biofuelsdigest.com/bdigest/2010/12/07/the-50-hottest-companies-in-bioenergy-for-2010-11/

The 50 Hottest Companies in Bioenergy for 2010-11 are:

Last year’s rank (2009-10)

1.            Amyris                              3

2.            Solazyme                          1

3.           POET                                 2

4.            LS9                                    8

5.            Gevo                                 13

6.            DuPont Danisco            7

7.            Novozymes                       11

8.             Coskata                             6

9.             Codexis                            35

10.            Sapphire Energy            5

11.             Virent                              21

12.             Mascoma                        10

13.             Ceres                                28

14.             Cobalt Technologies     30

15.             Honeywell’s UOP           12

16.             Enerkem                          25

17.             BP Biofuels                        4

18.             Genencor                         26

19.             Petrobras                          18

20.             Abengoa Energy             15

21.             Qteros                                22

22.             Joule Unlimited              32

23.             Shell                                    27

24.             Bluefire Renewables        19

25.             Rentech                              38

26.             Algenol                                24

27.             ZeaChem                             20

28.             PetroAlgae                          16

29.             Neste                                    29

30.             Synthetic Genomics           17

31.             LanzaTech                            41

32.             Iogen                                    23

33.             OriginOil                             42

34.             RangeFuels                         14

35.             ExxonMobil                        29

36.             Cargill                                    NR

37.             SG Biofuels                          49

38.             Butamax                              38

39.             Terrabon                              47

40.             Cosan                                    NR

41.             Verenium                              9

42.             Waste Management            42

43.             IneosBio                                36

44.             Dynamic Fuels                     NR

45.             Fulcrum Bioenergy              48

46.             KL Energy                             34

47.            KiOR                                       NR

48.             Chevron                                 NR

49.             Monsanto                              NR

50.             Inbicon                                    50

Produção de biodiesel por bactérias

ResearchBlogging.org

Imagine uma plantação enorme de soja no interior do Mato Grosso e uma instalação para a extração do óleo de soja, que é composto por vários ácidos graxos. Agora imagine no interior de São Paulo, uma grande usina de etanol cercada por dezenas de quilômetros por cana-de-açúcar. Imagine o etanol e óleo de soja sendo transportados até uma usina de biodiesel para, utilizando um catalisador (normalmente hidróxido de sódio), serem esterificados em um éster (biodiesel) e em glicerina. Muito trabalho e muito recurso para produzir um biocombustível não acham?

Recentemente, um trabalho muito interessante foi publicado pelo Jbei Instute demonstrando a possibilidade de se utilizar uma bactéria para produzir biodiesel em apenas uma etapa, e ainda por cima, utilizando resíduos agroindustriais, como por exemplo, o bagaço de cana-de-açúcar. Essa bactéria modificada geneticamente é capaz de produzir ácidos graxos e etanol e enzimaticamente realizar a esterificação desses produtos em biodiesel. Bacana não é? Os detalhes da pesquisa serão descritos a seguir.

Ácidos graxos têm sido utilizados há séculos para a produção de combustíveis e produtos químicos, incluindo o biodiesel, surfactantes, solventes e lubrificantes. Porém a demanda crescente e a produção limitada de óleos vegetais têm causado questionamentos sobre o aumento dos preços dos alimentos, sobre a prática de utilização dos solos e os aspectos socioambientais relacionados com a sua produção. Uma alternativa é a produção desses derivados de ácidos graxos via conversão biológica utilizando microrganismos como levedura e bactérias. Dentro desses produtos, os etil-ésteres de ácidos graxos (o famoso biodiesel) têm despertado muito interesse. Só para ilustrar, a demanda mundial de diesel vem crescendo três vezes mais que a de gasolina.

Ácidos graxos são produzidos naturalmente por microrganismos, eles compõem, entre outras coisas, a membrana celular. Porém, Jay Keasling e seu grupo construíram uma E. coli geneticamente modificada capaz de produzir ácidos graxos livres (através da expressão de uma tioesterase citoplasmática e da deleção de genes responsáveis pela degradação de ácidos graxos) e etanol (expressando os genes de Zymomonas mobilis). Além disso, foi clonada uma enzima (Acr1) capaz de realizar a transesterificação em bioedisel, sendo que que a glicerina produzida é reabsorvida pela bactéria para a produção de mais biodiesel.

O tamanho e a saturação do ácido graxo influenciam diretamente nas propriedades químicas do biodiesel, como temperatura de fusão. Alguns trabalhos têm demonstrado que,
através da expressão de tioesterases de plantas, é possível produzir ácidos graxos sob medida para diferentes aplicações. Essa ferramenta genética possibilita a produção de biodiesel com composições definidas, dessa maneira, com performance e características desenvolvidas sob medida.

Por fim, essas bactérias foram modificadas para utilizar matérias-primas de baixo custo, como a hemicelulose presente no bagaço de cana-de-açúcar. É uma pesquisa pioneira que mostra bem o tipo de engenharia sistêmica de metabolismo microbiano que vem sido feita. Através de várias modificações genéticas foi possível aumentar a produção de 40 mg/l para quase 700 mg/l de biodiesel. Resultado este ainda baixo para se cogitar uma aplicação a curto-prazo, mas, sem sombra de dúvida, as perspectivas são muito animadoras.

Steen EJ, Kang Y, Bokinsky G, Hu Z, Schirmer A, McClure A, Del Cardayre SB, & Keasling JD (2010). Microbial production of fatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass. Nature, 463 (7280), 559-62 PMID: 20111002

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