BioBricks: fabricação de pequenos fragmentos de DNA

Este protocolo é utilizado para a fabricação de BioBricks pequenos, como promotores ou sítios de ligação do ribossomo (RBS). Para isso, utiliza o anelamento e extensão dos primers para criar um pequeno fragmento de DNA (~ 100 bp) utilizando Taq polimerase de alta fidelidade. O fragmento de DNA pode ser imediatamente utilizado em uma reação de clonagem utilizando TOPO-TA. Caso se deseje realizar uma etapa de digestão do fragmento de DNA, uma etapa de purificação de produto de PCR é necessária.

Materiais:

- Dois primers que se sobrepõe por ~20 bp.

Primer 1:    5′ ———————————– 3′
Primer 2:                                        3′ ———————————– 5′

- Mix para PCR Taq alta fidelidade

Método

1. Diluir os dois oligos a uma concentração de 25 μM utilizando H2O. Para primers maiores que 50-60 bp podem ocorrer problemas como erros e deleções, por isso, pode valer a pena incluir uma etapa de purificação extra PAGE (Invitrogen).

2. Misturar os reagentes em um tubo estéril de 0.6 mL:

  • 9 μL PCR supermix
  • 0.5 μL primer 1
  • 0.5 μL primer 2

3. A reação de anelamento e extensão dos primers ocorrem no termociclador segundo o seguinte protocolo:

  1. 94°C por 5 mins
  2. 94°C por 30 seconds
  3. 55°C por 30 seconds (ou qualquer outra temperatura de anelamento)
  4. 72°C por 30 seconds
  5. Repita os passos 2-4 por 2-3 ciclos
  6. 72°C por 5 mins

4. Utilize 1μL de produto de PCR fresco (feito no mesmo dia) numa reação de clonagem com TOPO TA cloning.

Para desenhar um BioBrick por esse método não se esqueça de colocar o prefixo e sufixo dos BioBricks nos primers. Pronto, já descrevemos os protocolos para desenhar e montar um circuito sintético com promotores, RBS e genes.

Boa sorte e qualquer dúvida, por favor, pergunte!

Referências

Stemmer WP, Crameri A, Ha KD, Brennan TM, and Heyneker HL. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene 1995 Oct 16; 164(1) 49-53. pmid:7590320. PubMed HubMed PubGet [Stemmer-Gene-1995].

http://openwetware.org/wiki/Knight:Annealing_and_primer_extension_with_Taq_polymerase

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